Культивирование в условиях in vitro некоторых подвойных сортов винограда

Влияние питательных сред на продолжительность культивирования подвойных растений винограда в условиях in vitro

УДК 634.8: 581.14
ВЛИЯНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И ДОБАВОК К НИМ НА ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПОДВОЙНЫХ РАСТЕНИЙ ВИНОГРАДА В УСЛОВИЯХ IN VITRO
Н.О. Арестова
ГНУ Всероссийский НИИ виноградарства и виноделия им. Я.И. Потапенко Россельхозакадемии, г. Новочеркасск*
Приводятся результаты исследований влияния различных модификаций питательной среды Мурасиге-Скуга и добавок к ней на продолжительность культивирования подвойных растений in vitro без пересадок.

*Работа выполнена в лаборатории биотехнологии под руководством доктора с.-х. наук Н.П. Дорошенко.

Вопросы сохранения генофонда и создания коллекции растений винограда in vitro сложно решить без возможности их долговременного хранения в условиях культуры тканей. В связи с этим нашей целью был подбор такой питательной среды, которая ограничивала бы ростовые процессы растений, но не ухудшала их регенерационной способности. В опыте использовали следующие питательные среды: стандартная среда Мурасиге-Скуга (М-С), среда М-С в модификации Голодриги [1], Губаря [2], Высоцкой [3], а также среда М-С с добавлением тонко размолотых семян винограда (1 %) [4] и среда М-С, покрытая сверху вазелиновым маслом [5].
Отличие питательных сред в модификации Губаря и Голодриги от среды Мурасиге-Скуга (контроль) заключается в уменьшенном количестве питательных веществ при одинаковом качественном составе.
Исходным материалом для клонального микроразмножения и оздоровления исследуемых подвойных растений были почки вызревших побегов, из которых вычленяли апикальные меристемы.
Опыт по продолжительности хранения растений in vitro без пересадок осуществляли с использованием подвоя Феркаль.
В процессе культивирования пробирочных растений осуществляли контроль за ростом и развитием растений, наличием бактериального заражения и т.д. (2 раза в месяц). В частности, нами учитывались число корней, их длина, высота побега, количество листьев, выживаемость, причины гибели, продолжительность жизни.
Условия хранения пробирочных растений были достаточно благоприятны для их роста и развития, поэтому на замедление роста могла повлиять только питательная среда.
Из исследуемых питательных сред наиболее благоприятна для роста и развития растений была питательная среда М-С в модификации Голодриги. Максимальный срок культивирования растений на этой среде составлял 110-130 дней, после чего они были расчеренкованы. Растения на других средах отличались замедленным ростом, что позволило их культивировать без пересадки в течение 200-240 дней (табл. 1).
Таблица 1
Особенности роста пробирочных растений на разных питательных средах после 130-дневного культивирования (сорт Феркаль)

СОЗДАНИЕ И ХРАНЕНИЕ КОЛЛЕКЦИИ ВИНОГРАДА IN VITRO

Транскрипт

1 УДК : СОЗДАНИЕ И ХРАНЕНИЕ КОЛЛЕКЦИИ ВИНОГРАДА IN VITRO CREATING AND STORING OF GRAPE COLLECTION IN VITRO Н.П. Дорошенко, Т.В. Жукова ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт имени Я.И. Потапенко, г. Новочеркасск, Россия, е-mail: Аннотация. В статье приведены результаты исследований по депонированию винограда in vitro. Показаны способы подготовки к депонированию для оздоровления растений от вирусной и микоплазменной инфекции. Выявлены факторы, способствующие замедлению ростовых процессов, обеспечивающие продолжительное беспересадочное хранение. Создана и поддерживается коллекция из межвидовых сортов винограда селекции института, аборигенных, классических и подвойных сортов винограда. Ключевые слова: виноград, коллекция in vitro, ввод в культуру, способы замедления ростовых процессов, мелафен, салициловая кислота, цефотаксим. N.P. Doroshenko, T.V. Gukowa All-Russian Research Ya.I. Potapenko Institute for Viticulture and Winemaking, Novocherkassk, Russia, е-mail: Summary. The article presents the results of studies on the deposition of grapes in vitro. The methods of preparation for deposition for sanitation of plants from the virus and mycoplasma infection are shown. The factors were revealed, which facilitate growth processes, and ensure prolonged storage without replanting. We created and support the collection of interspecies grape varieties of institute s selection, aboriginal, classical and rootstock types of grapes. Keywords: grapes, collection in vitro, introduction into the culture, the methods of retarding of growth processes, melafen, salycilic acid, tsefotaksim. В условиях глобального экологического неблагополучия проблема сохранения генофонда растений приобретает особое значение. Традиционных средств сохранения биологического разнообразия растений уже недостаточно. Методы культивирования in vitro позволяют создать биотехнологию поддержания и хранения генофонда при замедленном росте этих объектов. Это актуально и для виноградарства. Насущной необходимостью является обеспечение коллекций материалом, находящимся под угрозой исчезновения. При хранении коллекций in vitro в оптимальных условиях роста растений (t =20 23ºC), возникает необходимость частого переноса

2 микрорастений на свежую питательную среду, что повышает стоимость хранения образца и увеличивает риск его инфицирования различными микроорганизмами. Кроме того, частое пассирование микропобегов стимулирует активное деление клеток, что может способствовать возникновению сомаклональных вариантов. Для увеличения интервала между пассажами используют различные методы и приемы, основанные на замедлении роста пробирочных растений. Цель исследований для создания генетического банка стерильных культур разработать способы среднесрочного хранения in vitro редких и ценных сортов винограда с учетом сортовых особенностей, состояния маточных растений и морфогенетических процессов, происходящих при этом. Исследования проводились в стационарных условиях лаборатории биотехнологии ВНИИВиВ по общепринятым в биотехнологии методикам [Уайт Ф.Р., 1949, Бутенко Р.Г., 1964; Голодрига П.Я. и др., 1986, Дорошенко Н.П., 1992] по трем направлениям: 1) ввод в культуру in vitro новых сортов: апикальные меристемы + хемотерапия; 2) исследование приемов замедления роста для среднесрочного хранения; 3) осуществление контроля над состоянием растений в процессе хранения и проведение перезакладки коллекции. Коллекции in vitro формируются из меристемных клонов, свободных от патогенов, и сохраняются в контролируемых условиях среды. Наиболее вредоносными патогенами как полевых, так и коллекций in vitro являются бактерии, вирусы и микоплазмы. Для оздоровления от вирусной инфекции оптимизирован способ введения в культуру апикальных меристем размером 0,3 0,2 мм (меристема с одной парой листовых зачатков); хемотерапии, проводимой салициловой кислотой, и антибактериальной хемотерапии, основанной на применении антибиотика цефотаксим. Введение в состав питательной среды антибиотика цефотаксим оказало положительное влияние на регенерацию меристем на этапе ввода (рис.1) и последующих этапах пролиферации и ризогенеза, способствуя оздоровлению растений. Выяснено, что салициловая кислота, также дополняет оздоровление апикальных меристем, улучшая качественные характеристики регенерированных растений, у которых уменьшается число растений со скрученными, шиповатыми листьями и число растений с тонкими корнями. Исследована возможность применения в составе питательной среды на этапе ввода в культуру in vitro нового перспективного препарата мелафен, который обладает высокой полифункциональной физиологической активностью в низких концентрациях и рекомендован в качестве регулятора роста растений, отвечающего современным

Статья по теме: Светлячок - гибридная форма винограда

3 требованиям технологий для испытания на ведущих сельскохозяйственных культурах [1]. А B C Рис. 1. Развитие меристем под действием салициловой кислоты (В) и цефотаксима (С), А контроль. В таблице 1 показано влияние антибиотика цефотаксим и регулятора роста мелафен на регенерацию меристем сорта Саперави северный. Технология создания коллекции генофонда винограда in vitro, основывалась на минимализации роста пробирочных растений при помощи пониженной температуры и освещенности, модификации состава питательной среды, применении повышенных концентраций сахарозы (4 5%), добавления в питательную среду ростовых и осмотических ингибиторов. Перед постановкой на хранение осуществлялось микроразмножение оздоровленных мериклонов, отбор растений и исследование факторов, способствующих замедлению ростовых процессов. Таблица 1 Результаты ввода в культуру меристем сорта Саперави северный, гг. Вариант, цефотак сим, мелафен гибе ль Характеристика состояния меристем, штук мелк. средн. крупн. слабый розетка до 1-3 мм более линейн, листьев 1 мм 3 мм рост Продо лжение ввода, шт. На про лиферац ию, шт. Контроль ЦФ Цф Цф Мф Мф Впервые осуществлено применение природных ингибиторов для депонирования растений винограда. Добавление в питательную среду семян винограда в повышенных концентрациях (1,0 %-ный порошок тонкоразмолотых семян или 20%-ная вытяжка) создает в ней такой уровень естественных ингибиторов, при котором наблюдается снижение ростовых процессов и возможно в 4 5 раз увеличить промежутки времени между пересадками растений на свежую питательную среду [2].

4 Предложены новые условия продолжительного хранения генофонда винограда: до месяцев и более без пересадок за счет использования питательной среды Мурасиге и Скуга, модифицированной для хранения, температуры 4 о С и освещенности 0,3 0,5 тыс. люкс. Выявлена возможность сохранения растений без пересадки в течение дней, используя питательную среду для длительного хранения и понизив освещённость до лк, не изменяя при этом параметры температурного режима [3]. Применение препарата мелафен способствует улучшению морфогенеза растений в культуре in vitro и качественных характеристик растений, регенерированных из меристем, при их микроразмножении [4, 5]. Кроме этого, выявлена возможность хранения растений в культуре in vitro на питательной среде с мелафеном в течение 10 месяцев. Доказана возможность беспересадочного культивирования пробирочных растений винограда в коллекции in vitro в течение 490 дней при введении в состав питательной среды нитрата кальция преимущественно в концентрациях 3,0, 1,5 и 7,5 мм. При повышенных концентрациях сахарозы (70 90 г/л) на начальном этапе культивирования четко проявляется снижение интенсивности ростовых процессов, которое выражается, в первую очередь, в замедлении роста растений. Однако при депонировании в течение 8 10 месяцев в этих вариантах наблюдается более интенсивное высыхание растений и снижение их жизнеспособности. Проведена сравнительная оценка всех изучаемых для депонирования препаратов. Отмечена высокая приживаемость микрочеренков и сохранность растений в течение 110 дней культивирования. При хранении в течение 270 дней также отмечена высокая сохранность растений, особенно, при добавлении в питательную среду препарата мелафен (табл. 2). Таблица 2 Состояние растений через 270 дней хранения в коллекции на питательных средах с различными препаратами, Баклановский, гг. Вариант Сохрани лось Высота, см Число листьев, шт. Коэфф. жизне Оставле но на препарат концентрация шт.% зеленых подсох ших способно сти хранени и, шт. Мелафен / 42,8 16,5 6,6 6,7 1,5 19 Гентамицин 0,05 21/37,5 10,0 6,7 7,2 0,8 15 Цефотаксим /33,9 18,5 6,7 7,6 1,1 15 Са(NО 3) 2 3,5 20/35,7 15,8 7,1 8,6 1,5 16 Салицил. к-та 0,14 19/33,9 16,8 8,3 8,5 1,6 16 Салицил. к-та 1,4 9/16,0 18,0 7,9 10,8 1,4 8

Статья по теме: Хачадор – крымский сорт винограда

5 Положительным является тот факт, что у растений был определен высокий коэффициент жизнеспособности в вариантах с мелафеном, Са(NО3) 2 и салициловой кислотой в концентрации 0,14 мг/л, что позволило продлить депонирование этих растений. Наблюдение было продолжено (табл. 3). Выявлена хорошая сохранность растений при беспересадочном культивировании в течение 270 и 450 дней, установлена возможность хранения отдельных растений в течение 540 и 630 дней. Лучшая продолжительность беспересадочного хранения отмечена в вариантах с применением в составе питательной среды препаратов мелафен, Са(NО3)2 и цефотаксим. Таким образом, в процессе исследований разработан цикл «введение в культуру in vitro микроразмножение» с учетом сортовых особенностей и состояния маточных растений. Определены факторы, обуславливающие в культуре in vitro замедление ростовых процессов мериклонов. Осуществлена сравнительная оценка различных факторов (свет, температура, состав питательной среды, регуляторы и ингибиторы роста, осмотики, антибиотики и т.д.) и параметров их применения для продолжительного хранения растений винограда в культуре in vitro. Таблица 3 Сохранность растений на питательных средах с различными препаратами, Баклановский, гг. Вариант Сохранилось растений, шт. при продолжительности хранения, дней препарат концентрация, мг/л Мелафен Гентамицин 0, Цефотаксим Са(NО 3) 2 3, Салициловая кислота 0, Салициловая – 1, кислота Создана коллекция из аборигенных сортов винограда: Варюшкин, Кабашный, Косоротовский, Красностоп золотовский, Крестовский, Кукановский, Кумшацкий, Пухляковский, Сибирьковый, Сыпун черный, Цимладар, Цимлянский белый, двух клонов сорта Цимлянский черный и ; сортов селекции института межвидового происхождения: Августа, Баклановский, Золотинка, Илья, Кармакод, Памяти Кострикина, Преображение, Фиолетовый ранний, Саперави северный, классических сортов: Каберне Совиньон, Мерло, Пино нуар,

6 Мускат масандра; подвойных сортов винограда: Гравесак, Кобер 5ББ, SO4, Рупестрис дю Ло, Феркаль и др. Всего в коллекции находятся 42 сорта винограда. Общее число растений Литература 1.Фаттахов, С.Г. Мелафен перспективный регулятор роста растений для сельского хозяйства и биотехнологии / С.Г. Фаттахов, В.С. Резник, А.И. Коновалов // Состояние исследований и перспективы применения регулятора роста нового поколении Мелафен в сельском хозяйстве и биотехнологии: материалы Всероссийского семинара совещания. Казань, С Дорошенко, Н.П. Применение растительной добавки для оптимизации клонального микроразмножения и длительного хранения винограда in vitro / Н..П. Дорошенко, Б.А. Музыченко // Регуляторы роста и развития растений. М., 1997, 290 с. 3. Дорошенко, Н.П. Хранение коллекции винограда in vitro при пониженной температуре / Н.П. Дорошенко, М.А. Козлова, О.Н. Высоцкая и др. // Виноград и вино России С Дорошенко, Н.П. Результаты исследования препарата «Мелафен» в культуре винограда in vitro / Н.П. Дорошенко // Мелафен: механизм действия и области применения / под ред. С.Г. Фаттахова. Казань: Печать Сервис ХХI век, 2014 С Дорошенко, Н.П. Препарат мелафен в культуре винограда in vitro / Н.П. Дорошенко, Т.В. Жукова // Научное наследие Я.И. Потапенко основа современной науки о винограде и вине: материалы международной научно-практической конференции, посвященной 110-летию со дня рождения Я.И. Потапенко. Новочеркасск, С

Применение салициловой кислоты на этапе ввода в культуру in vitro подвойных сортов винограда

УДК 634.8 037:581.143 6

ГНУ «Всероссийский научно – исследовательский институт виноградарства и виноделия им. Я.И. Потапенко» Россельхозакадемии, г. Новочеркасск

На этапе ввода подвойных сортов винограда Гравесак, SO4 Феркаль, 5С, Кобер 5ББ, RCB в культуру in vitro исследовали добавление в питательную среду Мурасиге и Скуга салициловой кислоты. Выявлено, что салициловая кислота в составе питательной среды способствует лучшей приживаемости меристем, улучшает новообразование узлов и побегов. Оптимальная концентрация – 1,4 мг/л.

Биотехнологические методы применяются в виноградарстве для клонального микроразмножения новых селекционных и интродуцированных сортов, оздоровления их от вирусной инфекции, интенсификации селекционного процесса, сохранения банка сортов в культуре in vitro.

При помощи культуры апикальных меристем разработана технология получения корнесобственного посадочного материала высшей категории качества (класс А). Для получения привитого посадочного материала этой категории необходимо оздоровление подвойных сортов. С этой целью при оздоровлении подвоев исследовано применение салициловой кислоты. Салициловая кислота (СК), которую некоторые авторы относят к новому классу фитогормонов, способна индуцировать у растений цветение и термогинез, а также играть роль сигнальной молекулы при патогенезах, что делает перспективным использование СК на зерновых культурах в периоды, когда вероятность инфицирования патогенами высока. М. Безрукова и др.[1 ] отмечают антиоксидантные свойства СК и её способность поддерживать целостность мембранных структур клеток при воздействии стрессовых факторов. И.П. Воловник и др. обнаружили уменьшение проницаемости мембран под влиянием 100 мкМ СК, что сопровождалось повышением морозоустойчивости проростков озимой пшеницы на 30 % [2].
В результате исследований Т.Ф. Сосновской и др. [3] показано, что экзогенная СК, проникая в клетки, активирует весь комплекс протеиназно-ингибиторной системы растений, что может способствовать усилению адаптационного ответа на неблагоприятные факторы внешней среды, то есть может быть использована при разработке экологически безопасных способов повышения иммунитета сельскохозяйственных растений.
О.А.Тимофеева, Т.В. Трифонова, Н.А. Шадрина [4] установили, что салициловая кислота может выступать в качестве индуктора системной приобретенной устойчивости не только к инфекции, но и к действию низких температур.
Ученые из ИФР им. К.А. Тимирязева и кафедры вирусологии МГУ [5] выявили, что в присутствии салициловой кислоты происходит ингибирование распространения вируса ВТМ, одной из причин которого они считают снижение проводимости плазмодесм и межклеточного транспорта вируса, что делает особо привлекательным применение салициловой кислоты при оздоровлении и клональном микроразмножении в культуре изолированных тканей и органов.
В то же время, в известной нам научной литературе данные об использовании салициловой кислоты in vitro немногочисленны. К ним можно отнести работы М.Т. Упадышева, А.Д. Петровой [6, 7], которые в процессе хемотерапии выявили наибольшую антивирусную активность салициловой кислоты в отношении вирусов различной природы у ягодных и плодовых культур.
Установлено положительное действие салициловой кислоты на укоренение микропобегов трудноукореняемых сортов роз. Акклиматизированные в открытом грунте растения проявляли высокую зимостойкость и высокую, в течение периода вегетации, экорезистентность на протяжении 10 лет [8].
Все вышеизложенное послужило основанием для включения салициловой кислоты в программу исследований на этапе ввода растений винограда в культуру in vitro с целью улучшения адаптации меристем к условиям культивирования и повышения устойчивости их к вирусной инфекции.
Для оздоровления из вызревших глазков в начале февраля выделяли меристематические экспланты размером 0.1-0,2 мм. Ввод в культуру был разделен на два этапа с чередованием твердой и жидкой питательных сред. Салициловая кислота вводилась в состав питательной среды Мурасиге – Скуга в концентрациях 0,14; 1,4; 14,0 мг/л.
Результаты исследования показали, что у всех изучаемых сортов в контроле (без добавления салициловой кислоты) произошла полная гибель меристем – частично от инфекции, но в основном из-за отсутствия развития и последующего некроза тканей. При применении салициловой кислоты сорта различались между собой по интенсивности репаративной регенерации меристем. По степени её возрастания их можно разместить следующим образом: Гравесак, S04, Феркаль, 5С, Кобер 5ББ, RCB.
Самая высокая приживаемость меристем у всех сортов отмечена при концентрации салициловой кислоты 1,4 мг/л. Так, у сорта Гравесак она составила 35, %; сортов S04 и Феркаль – 57,1%; 5 С и Кобер 5ББ – 64,2 %, RCB – 71,4 %.При увеличении концентрации салициловой кислоты до 14,0 мг/л регенерация меристем резко ухудшалась. Особенно четко это проявилось у сортов Гравесак, Феркаль, RCB. Более устойчивыми к высокой концентрации салициловой кислоты оказались сорта SO4, 5С и Кобер 5ББ.
Введение салициловой кислоты в состав питательной среды оказало влияние на продуктивную регенерацию (новообразование побегов) в ходе следующего этапа собственно микроразмножения, причем это влияние также зависело от сортовых особенностей.
Очень поздно началась пролиферация у сорта S04 и была слабой. Образовались лишь единичные побеги, но, тем не менее, видно четкое положительное влияние применения салициловой кислоты в концентрации 1,4 мг/л – 70,5 % побегов образовалось в этом варианте.
У сорта Кобер 5ББ пролиферация началась раньше, но также была слабой и растянутой. Салициловая кислота оказала положительное влияние на новообразование побегов как при концентрации 1,4, так и при концентрации 14,0 мг/л.
Образование побегов у сорта Гравесак началось на 83 день культивирования, было непродолжительным, все побеги (42 шт.) образовались в варианте с 1,4 мг/л салициловой кислоты.
Более продолжительная пролиферация отмечалась у сорта Феркаль. Основное количество побегов образоватось в варианте с концентрацией салициловой кислоты 1,4 мг/л, но и при концентрации 0,14 мг/л образовалось 24,6 % побегов.
Пролиферация у сорта 5С началась достаточно рано – на 83 день культивирования, была продолжительной. Следует отметить, что развитие меристем происходило настолько интенсивно, что некоторые из них были сразу пересажены в колбы для пролиферации, минуя второй этап ввода.
Наиболее пластичным при вводе в культуру тканей оказался сорт RCB. Уже на 70 день культивирования 7 меристем были пересажены в колбы, а через последующие 30 дней были срезаны первые побеги. Салициловая кислота оказала положительное влияние на образование побегов: лучший результат получен при концентрации 1,4 мг/л, хороший при концентрации 0,14 мг/л, в концентрации 14,0 мг/л она ингибировала образование побегов.
В таблице приведены данные по всем изучаемым сортам, из которых четко видно положительное влияние салициловой кислоты на новообразование узлов и побегов на этапе собственно микроразмножения. Наибольшее количество побегов в опыте образовалось и срезано при концентрации салициловой кислоты 1,4 мг/л -78,4 %.