Выделение в культуру уксуснокислых бактерий – Уксуснокислые бактерии

Уксуснокислые бактерии

Уксуснокислые бактерии, выделенные в роды Gluconobacter и Acetobacter, могут получать энергию, осуществляя неполное окисление ряда органических соединений. Это грамотрицательные бесспоровые палочки, слабоподвижные за счет перитрихиально или полярно расположенных жгутиков, или неподвижные. Облигатные аэробы. Довольно требовательны к субстратам для роста. Почти все виды нуждаются в отдельных витаминах, в первую очередь в пантотеновой кислоте, однако есть формы, способные к синтезу всех факторов роста.

К числу окисляемых соединений относятся одноатомные спирты, содержащие от 2 до 5 углеродных атомов, а также многоатомные спирты — производные сахаров. Окисление первичных спиртов приводит к образованию кислот. Например, этанол с помощью соответствующих дегидрогеназ окисляется до ацетата:

Вторичные спирты окисляются до кетонов:

Многоатомные спирты окисляются этими бактериями в альдозы и кетозы, например: сорбит ® сорбоза; глицерин ® диоксиацетон. Альдозы и кетозы могут далее окисляться в соответствующие кислоты. Метаболизирование cахаров осуществляется по окислительному пентозофосфатному пути.

Круг окисляемых соединений различен для разных представителей, входящих в эту группу. С точки зрения характеристики энергетических возможностей уксуснокислых бактерий важно подчеркнуть, что у них развилась удивительная способность воздействовать на определенные химические группировки” осуществляя их одно- или двухступенчатое окисление. Наиболее характерна способность этих бактерий окислять этиловый спирт в уксусную кислоту, давшая название всей группе в целом.

Дальнейшая судьба полученных в результате неполного окисления продуктов различна. Некоторые уксуснокислые бактерии не способны к последующим превращениям образовавшихся соединений, и их окислительные способности, следовательно, весьма ограничены. Эти бактерии, объединенные в род Gluconobacter (единственный вид G. oxydans), глюкозу окисляют до глюконовой кислоты, этанол — только до ацетата, который дальше не может ими окисляться из-за отсутствия “замкнутого” ЦТК.

Вторую группу составляют бактерии, способные к полному окислению органических субстратов до CO₂ и H₂O. В этом случае образовавшаяся уксусная кислота представляет собой лишь промежуточный этап, и после исчерпания из среды исходного субстрата бактерии начинают медленно окислять уксусную кислоту, включая ее в механизм конечного окисления — ЦТК. Бактерии этой группы объединены в род Acetobacter, типичным представителем которого является A. peroxydans.

Электроны от окисляемых субстратов поступают в дыхательную цепь и далее через систему переносчиков передаются на O₂, служащий обязательным конечным акцептором электронов. Электронный транспорт приводит к генерированию Dm_H + .

Место включения электронов в дыхательную цепь определяется ферментом, катализирующим соответствующую окислительную реакцию. Если окисление катализируется НАД-зависимой дегидрогеназой, электроны (водород) передаются на НАД + и с него на переносчики, локализованные на мембране, что открывает возможность для сопряжения электронного транспорта с тремя трансмембранными перемещениями протонов и, соответственно, синтезом 3 молекул АТФ. Недавно у представителей родов Acetobacter и Gluconobacter были обнаружены дегидрогеназы, содержащие в качестве простетической группы соединение из группы хинонов, способные принимать и отдавать 2 атома водорода. Хинонсодержащие дегидрогеназы локализованы на внешней стороне ЦПМ, где и происходит окисление этанола и других соединений. Электроны поступают в дыхательную цепь на уровне цитохромов, а протоны выделяются в периплазматическое пространство.

Уксуснокислые бактерии часто развиваются вслед за дрожжами, используя продукт спиртового брожения как субстрат для роста. Применяются в микробиологической промышленности для получения столового уксуса и в производстве аскорбиновой кислоты (на этапе окисления сорбита в сорбозу).

Выделение в культуру уксуснокислых бактерий – Уксуснокислые бактерии

Морфологические признаки. Морфологию уксуснокислых бактерий изучают при выращивании культур на какой-либо из описанных питательных сред, например, на вине с суслом. Определяют внешние признаки (характер пленки на жидкой среде и колоний — на плотной), вид клеток под микроскопом (форма и подвижность), размеры и др.

Пробу на каталазу ведут упрощенным методом: на предметное стекло берут каплю перекиси водорода и добавляют одну петлю бактериальной массы. При микроскопировании с малым увеличением в случае наличия каталазы у культуры наблюдается интенсивное выделение пузырьков кислорода.

Способность окислять этиловый спирт и уксусную кислоту. Для изучения этого свойства делают посев культуры бактерий на дрожжевой агар с 3% об. этилового спирта или уксусной кислоты и 2% мела. Через 3—4 сут вокруг колоний уксуснокислых бактерий возникают зоны растворения мела.

Способность окислять молочную кислоту. Ее определяют посевом бактерий на дрожжевой агар с 2% лактата кальция. Через несколько дней вокруг колоний бактерий, окисляющих молочную. кислоту, образуется расплывчатый белый ореол.

Кетогенная способность. Определяется по методу оксидо-грамм Фратера. Для получения их на поверхность дрожжевого агара с глицерином (2%) в чашках Петри наносят (петлей, пипеткой) густую бактериальную массу. Чашки выдерживают в термостате при температуре 30°С. Через сутки агар осторожно заливают раствором Фелинга. Бактерии, окисляющие глицерин в диоксиацетон, образуют закись меди, и зона вокруг бактериальной массы окрашивается в желтый цвет. По количеству за-кисной меди можно судить об относительной активности окисления многоатомных спиртов в кетосоединения.

Способность к окислению глюкозы. Для определения способности бактерий окислять глюкозу в глюконовую кислоту делают их посев на дрожжевой агар, содержащий 10% глюкозы и 3% мела. Вокруг колоний бактерий, окисляющих глюкозу, образу ются прозрачные зоны. Если бактерии обладают способностью

окислять глюконовую кислоту, то позднее вокруг колоний образуются кристаллы глюконата кальция.

Реакция на целлюлозу. Определяется раствором йода (0,5 г йода в 100 мл 1,5%-ного раствора йодистого калия), В каплю раствора на предметном стекле вносят каплю бактериальной пленки и добавляют 2 капли 50—60%-ной (по объему) серной кислоты. О наличии целлюлозы судят по окрашиванию клеток в синий цвет.

Колонии бактерий, образующие крахмал, также окрашиваются в синий цвет.

Способность уксуснокислых бактерий усваивать различные источники углерода (сахара, спирты, кислоты). Эту способность определяют по интенсивности роста бактерий (в пробирках или в чашках Петри) на плотной синтетической питательной среде Ридер с добавлением 0,1%-ного дрожжевого автолизата. В качестве индикатора добавляют на 100 мл среды 3 мл 0,04%-ного щелочного раствора бромтимол синего. Сахара и спирты добавляют в количестве 1%, органические кислоты — 0,2% (уксусная кислота 0,1%). Контролем служит среда без добавления источников углерода. Степень усвоения источников углерода оценивают по массе выросших бактерий и изменению цвета индикатора.

Значение уксуснокислых бактерий

Многим виноделам известна ситуация, когда из-за попадания в сосуд воздуха на поверхности напитка образовывалась пленка. Данный процесс полностью портит вкус и свойства вина, делая его непригодным для употребления, а спровоцирован он бактериями уксуснокислого брожения. Сами по себе такие микроорганизмы не представляют опасности и всегда находятся в вине и пиве, вред они начинают наносить только при контакте с воздухом.

Но сегодня и это, казалось бы, не очень хорошее свойство используют на благо человечества в определенных отраслях промышленности.

Что представляют собой бактерии

Самым ярким примером работы уксуснокислых бактерий является скисание слабоалкогольного вина. Явление это было известно еще в древности, но научное объяснение процессу было дано только в 60-е годы позапрошлого века французским микробиологом Луи Пастером. Именно он открыл возбудителей появления мутной пленки на поверхности вина, которая и вызывает его скисание, проще говоря, превращение в уксус.

Свойственно это слабоалкогольным напиткам, оставленным в неполных открытых сосудах со свободным доступом воздуха. При дальнейшем изучении оказалось, что открытый химиком «уксусный гриб» на самом деле представляет собой целый вид различных бактерий.

Способности микроорганизмов

Уксуснокислые бактерии в реальности задействованы в процессах не только скисания вин. Они способны окислять такие спирты, как этиловый, пропиловый и бутиловый, образовывая из них уксусную, пропионовую и масляную кислоты соответственно. То есть любой напиток с содержанием такого спирта может быть испорчен благодаря жизнедеятельности бактерий. Не стоит опасаться только за жидкости, содержащие метиловый и высшие спирты, поскольку они при окислении образуют ядовитый для микроорганизмов продукт.

Особенности процесса

Само окисление спиртов под воздействием уксуснокислых бактерий представляет собой дегидрирование. Весь процесс можно выразить в химической формуле, где изначально берется этиловый спирт, превращаемый под воздействием кислорода в уксусную кислоту, воду и выделяемую энергию:

Если спирта в среде находится слишком много, то результатом процесса будет образование только кислоты и минимальный выброс энергии, чего недостаточно для дальнейшей жизнедеятельности бактерий. Именно поэтому им приходиться окислять как можно большее количество спирта, что сближает окисление с другими анаэробными процессами, но оставляет его индивидуальным по определенным характеристикам.

Особенности

Отличительной чертой воздействия уксуснокислых бактерий всегда остается образование на поверхности субстрата пленки.

Работа уксуснокислых бактерий и их свойства зависят от разновидности микроорганизмов и могут менять цвет, толщину, крепость и другие характеристики. На сегодняшний день открыто уже огромное количество видов этих типичных аэробов. Все они способны размножаться очень быстро, особенно при добавлении в исходную жидкость готовой уксусной кислоты, чем и ускоряют процесс получения уксуса на производстве. В жизни уксуснокислые бактерии встречаются в воздухе, почве, любом продукте брожения, на поверхности ягод и плодов, воды и так далее.

Внешнее описание

В идеальных условиях клетки представляют собой короткие палочки и не образуют спор. В зависимости от возраста, среды обитания и множества второстепенных причин форма и размер микроорганизмов может меняться. Неблагоприятные условия провоцируют клетки увеличиваться и иногда покрываться слизью. В большом количестве они образуют слизевые скопления.

Особое влияние на жизнедеятельность клеток имеет температура. Если ее показатель ниже 15 градусов, то размножение будет замедлено, а внешне бактерии будут представлять собой короткие и толстые палочки. При показателе до 34 градусов среда считается идеальной, и клетки чувствуют себя хорошо. При повышении же возможно образование различных уродств в форме.

Полезные свойства

Помимо того, что жизнедеятельность бактерий наносит вред виноделию, можно выделить и целый ряд примеров удачного использования человеком характеристик микроорганизмов.

Так, главная роль уксуснокислым бактериям отведена в производстве и изготовлении столового уксуса из вина или разбавленного спирта. Осуществляется это по сей день двумя способами.

Первый представляет собой более медленный, но тщательный процесс, называемый орлеанским или просто французским. Для него необходимо подготовить вино, предварительно подкисленное или разбавленное водой. Поместить его в подготовленные плоские емкости, чтобы поверхность соприкосновения с воздухом была максимальной, и выпустить в жидкость частицы уже образованной ранее пленки Acetobacter orleanense. Она имеет желтый цвет и прочную текстуру, позволяющую сохранить прозрачность жидкости под ней.

После окончания брожения из емкости аккуратно забирают часть субстрата и заменяют его аналогичным количеством разбавленного вина, после чего процесс возобновляется.

Второй способ более быстрый и применим для окисления разбавленного спирта. Для этого его пропускают через специальные емкости с буковыми стружками, чтобы также увеличить поверхность сцепления с бактериями. Емкости при этом обязательно снабжены ложными доньями с возможностью пропускать через них воздух. Таким образом, разбрызгиваемый потоками воздуха спирт оседает на стружке и окисляется, после чего его отбирают из сосуда снизу, а сверху доливают новый субстрат.

Кроме этого клетки используются при:

• мочении яблок вместе с дрожжами;
• производстве аскорбиновой кислоты;
• выращивании чайного гриба;
• изготовлении кефира.

Вообще, в производстве абсолютно всех молочнокислых продуктов наблюдается параллельное брожение, то есть молочнокислые и уксуснокислые бактерии вместе обеспечивают появление продуктов переработки молока в таком виде, как мы и привыкли.

Негативные свойства

Несмотря на такое положительное значение, уксуснокислые бактерии предполагают и опасность для определенных отраслей. Так, в виноделии микроорганизмы считаются патогенными, поскольку способны провоцировать процесс брожения, несмотря на то что они практически всегда содержатся в пиве и вине. Для их деактивации следует тщательно укупоривать напитки от контакта с воздухом, ведь именно он и провоцирует начало брожения. Полученная от закисания вина уксусная кислота всегда собирается на дне, откуда ее можно собрать, но вкус и аромат оставшегося напитка уже навсегда будет испорчен.

Если начавшийся процесс игнорировать, то все содержимое емкости может превратиться в обычный винный уксус.

Аналогичным образом бактерии способны вызывать закисание засоленных или маринованных овощей.

Источники:

http://studopedia.ru/11_222087_uksusnokislie-bakterii.html
http://sinref.ru/000_uchebniki/05599_vinodelie/020_mikrobiologia_vinodel/066.htm
http://fb.ru/article/369078/znachenie-uksusnokislyih-bakteriy