Влияние питательных сред и добавок к ним на продолжительность культивирования подвойных растений винограда в условиях in vitro

Влияние питательных сред на продолжительность культивирования подвойных растений винограда в условиях in vitro

УДК 634.8: 581.14
ВЛИЯНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И ДОБАВОК К НИМ НА ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПОДВОЙНЫХ РАСТЕНИЙ ВИНОГРАДА В УСЛОВИЯХ IN VITRO
Н.О. Арестова
ГНУ Всероссийский НИИ виноградарства и виноделия им. Я.И. Потапенко Россельхозакадемии, г. Новочеркасск*
Приводятся результаты исследований влияния различных модификаций питательной среды Мурасиге-Скуга и добавок к ней на продолжительность культивирования подвойных растений in vitro без пересадок.

*Работа выполнена в лаборатории биотехнологии под руководством доктора с.-х. наук Н.П. Дорошенко.

Вопросы сохранения генофонда и создания коллекции растений винограда in vitro сложно решить без возможности их долговременного хранения в условиях культуры тканей. В связи с этим нашей целью был подбор такой питательной среды, которая ограничивала бы ростовые процессы растений, но не ухудшала их регенерационной способности. В опыте использовали следующие питательные среды: стандартная среда Мурасиге-Скуга (М-С), среда М-С в модификации Голодриги [1], Губаря [2], Высоцкой [3], а также среда М-С с добавлением тонко размолотых семян винограда (1 %) [4] и среда М-С, покрытая сверху вазелиновым маслом [5].
Отличие питательных сред в модификации Губаря и Голодриги от среды Мурасиге-Скуга (контроль) заключается в уменьшенном количестве питательных веществ при одинаковом качественном составе.
Исходным материалом для клонального микроразмножения и оздоровления исследуемых подвойных растений были почки вызревших побегов, из которых вычленяли апикальные меристемы.
Опыт по продолжительности хранения растений in vitro без пересадок осуществляли с использованием подвоя Феркаль.
В процессе культивирования пробирочных растений осуществляли контроль за ростом и развитием растений, наличием бактериального заражения и т.д. (2 раза в месяц). В частности, нами учитывались число корней, их длина, высота побега, количество листьев, выживаемость, причины гибели, продолжительность жизни.
Условия хранения пробирочных растений были достаточно благоприятны для их роста и развития, поэтому на замедление роста могла повлиять только питательная среда.
Из исследуемых питательных сред наиболее благоприятна для роста и развития растений была питательная среда М-С в модификации Голодриги. Максимальный срок культивирования растений на этой среде составлял 110-130 дней, после чего они были расчеренкованы. Растения на других средах отличались замедленным ростом, что позволило их культивировать без пересадки в течение 200-240 дней (табл. 1).
Таблица 1
Особенности роста пробирочных растений на разных питательных средах после 130-дневного культивирования (сорт Феркаль)

СОЗДАНИЕ И ХРАНЕНИЕ КОЛЛЕКЦИИ ВИНОГРАДА IN VITRO

Транскрипт

1 УДК : СОЗДАНИЕ И ХРАНЕНИЕ КОЛЛЕКЦИИ ВИНОГРАДА IN VITRO CREATING AND STORING OF GRAPE COLLECTION IN VITRO Н.П. Дорошенко, Т.В. Жукова ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт имени Я.И. Потапенко, г. Новочеркасск, Россия, е-mail: Аннотация. В статье приведены результаты исследований по депонированию винограда in vitro. Показаны способы подготовки к депонированию для оздоровления растений от вирусной и микоплазменной инфекции. Выявлены факторы, способствующие замедлению ростовых процессов, обеспечивающие продолжительное беспересадочное хранение. Создана и поддерживается коллекция из межвидовых сортов винограда селекции института, аборигенных, классических и подвойных сортов винограда. Ключевые слова: виноград, коллекция in vitro, ввод в культуру, способы замедления ростовых процессов, мелафен, салициловая кислота, цефотаксим. N.P. Doroshenko, T.V. Gukowa All-Russian Research Ya.I. Potapenko Institute for Viticulture and Winemaking, Novocherkassk, Russia, е-mail: Summary. The article presents the results of studies on the deposition of grapes in vitro. The methods of preparation for deposition for sanitation of plants from the virus and mycoplasma infection are shown. The factors were revealed, which facilitate growth processes, and ensure prolonged storage without replanting. We created and support the collection of interspecies grape varieties of institute s selection, aboriginal, classical and rootstock types of grapes. Keywords: grapes, collection in vitro, introduction into the culture, the methods of retarding of growth processes, melafen, salycilic acid, tsefotaksim. В условиях глобального экологического неблагополучия проблема сохранения генофонда растений приобретает особое значение. Традиционных средств сохранения биологического разнообразия растений уже недостаточно. Методы культивирования in vitro позволяют создать биотехнологию поддержания и хранения генофонда при замедленном росте этих объектов. Это актуально и для виноградарства. Насущной необходимостью является обеспечение коллекций материалом, находящимся под угрозой исчезновения. При хранении коллекций in vitro в оптимальных условиях роста растений (t =20 23ºC), возникает необходимость частого переноса

2 микрорастений на свежую питательную среду, что повышает стоимость хранения образца и увеличивает риск его инфицирования различными микроорганизмами. Кроме того, частое пассирование микропобегов стимулирует активное деление клеток, что может способствовать возникновению сомаклональных вариантов. Для увеличения интервала между пассажами используют различные методы и приемы, основанные на замедлении роста пробирочных растений. Цель исследований для создания генетического банка стерильных культур разработать способы среднесрочного хранения in vitro редких и ценных сортов винограда с учетом сортовых особенностей, состояния маточных растений и морфогенетических процессов, происходящих при этом. Исследования проводились в стационарных условиях лаборатории биотехнологии ВНИИВиВ по общепринятым в биотехнологии методикам [Уайт Ф.Р., 1949, Бутенко Р.Г., 1964; Голодрига П.Я. и др., 1986, Дорошенко Н.П., 1992] по трем направлениям: 1) ввод в культуру in vitro новых сортов: апикальные меристемы + хемотерапия; 2) исследование приемов замедления роста для среднесрочного хранения; 3) осуществление контроля над состоянием растений в процессе хранения и проведение перезакладки коллекции. Коллекции in vitro формируются из меристемных клонов, свободных от патогенов, и сохраняются в контролируемых условиях среды. Наиболее вредоносными патогенами как полевых, так и коллекций in vitro являются бактерии, вирусы и микоплазмы. Для оздоровления от вирусной инфекции оптимизирован способ введения в культуру апикальных меристем размером 0,3 0,2 мм (меристема с одной парой листовых зачатков); хемотерапии, проводимой салициловой кислотой, и антибактериальной хемотерапии, основанной на применении антибиотика цефотаксим. Введение в состав питательной среды антибиотика цефотаксим оказало положительное влияние на регенерацию меристем на этапе ввода (рис.1) и последующих этапах пролиферации и ризогенеза, способствуя оздоровлению растений. Выяснено, что салициловая кислота, также дополняет оздоровление апикальных меристем, улучшая качественные характеристики регенерированных растений, у которых уменьшается число растений со скрученными, шиповатыми листьями и число растений с тонкими корнями. Исследована возможность применения в составе питательной среды на этапе ввода в культуру in vitro нового перспективного препарата мелафен, который обладает высокой полифункциональной физиологической активностью в низких концентрациях и рекомендован в качестве регулятора роста растений, отвечающего современным

3 требованиям технологий для испытания на ведущих сельскохозяйственных культурах [1]. А B C Рис. 1. Развитие меристем под действием салициловой кислоты (В) и цефотаксима (С), А контроль. В таблице 1 показано влияние антибиотика цефотаксим и регулятора роста мелафен на регенерацию меристем сорта Саперави северный. Технология создания коллекции генофонда винограда in vitro, основывалась на минимализации роста пробирочных растений при помощи пониженной температуры и освещенности, модификации состава питательной среды, применении повышенных концентраций сахарозы (4 5%), добавления в питательную среду ростовых и осмотических ингибиторов. Перед постановкой на хранение осуществлялось микроразмножение оздоровленных мериклонов, отбор растений и исследование факторов, способствующих замедлению ростовых процессов. Таблица 1 Результаты ввода в культуру меристем сорта Саперави северный, гг. Вариант, цефотак сим, мелафен гибе ль Характеристика состояния меристем, штук мелк. средн. крупн. слабый розетка до 1-3 мм более линейн, листьев 1 мм 3 мм рост Продо лжение ввода, шт. На про лиферац ию, шт. Контроль ЦФ Цф Цф Мф Мф Впервые осуществлено применение природных ингибиторов для депонирования растений винограда. Добавление в питательную среду семян винограда в повышенных концентрациях (1,0 %-ный порошок тонкоразмолотых семян или 20%-ная вытяжка) создает в ней такой уровень естественных ингибиторов, при котором наблюдается снижение ростовых процессов и возможно в 4 5 раз увеличить промежутки времени между пересадками растений на свежую питательную среду [2].

4 Предложены новые условия продолжительного хранения генофонда винограда: до месяцев и более без пересадок за счет использования питательной среды Мурасиге и Скуга, модифицированной для хранения, температуры 4 о С и освещенности 0,3 0,5 тыс. люкс. Выявлена возможность сохранения растений без пересадки в течение дней, используя питательную среду для длительного хранения и понизив освещённость до лк, не изменяя при этом параметры температурного режима [3]. Применение препарата мелафен способствует улучшению морфогенеза растений в культуре in vitro и качественных характеристик растений, регенерированных из меристем, при их микроразмножении [4, 5]. Кроме этого, выявлена возможность хранения растений в культуре in vitro на питательной среде с мелафеном в течение 10 месяцев. Доказана возможность беспересадочного культивирования пробирочных растений винограда в коллекции in vitro в течение 490 дней при введении в состав питательной среды нитрата кальция преимущественно в концентрациях 3,0, 1,5 и 7,5 мм. При повышенных концентрациях сахарозы (70 90 г/л) на начальном этапе культивирования четко проявляется снижение интенсивности ростовых процессов, которое выражается, в первую очередь, в замедлении роста растений. Однако при депонировании в течение 8 10 месяцев в этих вариантах наблюдается более интенсивное высыхание растений и снижение их жизнеспособности. Проведена сравнительная оценка всех изучаемых для депонирования препаратов. Отмечена высокая приживаемость микрочеренков и сохранность растений в течение 110 дней культивирования. При хранении в течение 270 дней также отмечена высокая сохранность растений, особенно, при добавлении в питательную среду препарата мелафен (табл. 2). Таблица 2 Состояние растений через 270 дней хранения в коллекции на питательных средах с различными препаратами, Баклановский, гг. Вариант Сохрани лось Высота, см Число листьев, шт. Коэфф. жизне Оставле но на препарат концентрация шт.% зеленых подсох ших способно сти хранени и, шт. Мелафен / 42,8 16,5 6,6 6,7 1,5 19 Гентамицин 0,05 21/37,5 10,0 6,7 7,2 0,8 15 Цефотаксим /33,9 18,5 6,7 7,6 1,1 15 Са(NО 3) 2 3,5 20/35,7 15,8 7,1 8,6 1,5 16 Салицил. к-та 0,14 19/33,9 16,8 8,3 8,5 1,6 16 Салицил. к-та 1,4 9/16,0 18,0 7,9 10,8 1,4 8

5 Положительным является тот факт, что у растений был определен высокий коэффициент жизнеспособности в вариантах с мелафеном, Са(NО3) 2 и салициловой кислотой в концентрации 0,14 мг/л, что позволило продлить депонирование этих растений. Наблюдение было продолжено (табл. 3). Выявлена хорошая сохранность растений при беспересадочном культивировании в течение 270 и 450 дней, установлена возможность хранения отдельных растений в течение 540 и 630 дней. Лучшая продолжительность беспересадочного хранения отмечена в вариантах с применением в составе питательной среды препаратов мелафен, Са(NО3)2 и цефотаксим. Таким образом, в процессе исследований разработан цикл «введение в культуру in vitro микроразмножение» с учетом сортовых особенностей и состояния маточных растений. Определены факторы, обуславливающие в культуре in vitro замедление ростовых процессов мериклонов. Осуществлена сравнительная оценка различных факторов (свет, температура, состав питательной среды, регуляторы и ингибиторы роста, осмотики, антибиотики и т.д.) и параметров их применения для продолжительного хранения растений винограда в культуре in vitro. Таблица 3 Сохранность растений на питательных средах с различными препаратами, Баклановский, гг. Вариант Сохранилось растений, шт. при продолжительности хранения, дней препарат концентрация, мг/л Мелафен Гентамицин 0, Цефотаксим Са(NО 3) 2 3, Салициловая кислота 0, Салициловая – 1, кислота Создана коллекция из аборигенных сортов винограда: Варюшкин, Кабашный, Косоротовский, Красностоп золотовский, Крестовский, Кукановский, Кумшацкий, Пухляковский, Сибирьковый, Сыпун черный, Цимладар, Цимлянский белый, двух клонов сорта Цимлянский черный и ; сортов селекции института межвидового происхождения: Августа, Баклановский, Золотинка, Илья, Кармакод, Памяти Кострикина, Преображение, Фиолетовый ранний, Саперави северный, классических сортов: Каберне Совиньон, Мерло, Пино нуар,

6 Мускат масандра; подвойных сортов винограда: Гравесак, Кобер 5ББ, SO4, Рупестрис дю Ло, Феркаль и др. Всего в коллекции находятся 42 сорта винограда. Общее число растений Литература 1.Фаттахов, С.Г. Мелафен перспективный регулятор роста растений для сельского хозяйства и биотехнологии / С.Г. Фаттахов, В.С. Резник, А.И. Коновалов // Состояние исследований и перспективы применения регулятора роста нового поколении Мелафен в сельском хозяйстве и биотехнологии: материалы Всероссийского семинара совещания. Казань, С Дорошенко, Н.П. Применение растительной добавки для оптимизации клонального микроразмножения и длительного хранения винограда in vitro / Н..П. Дорошенко, Б.А. Музыченко // Регуляторы роста и развития растений. М., 1997, 290 с. 3. Дорошенко, Н.П. Хранение коллекции винограда in vitro при пониженной температуре / Н.П. Дорошенко, М.А. Козлова, О.Н. Высоцкая и др. // Виноград и вино России С Дорошенко, Н.П. Результаты исследования препарата «Мелафен» в культуре винограда in vitro / Н.П. Дорошенко // Мелафен: механизм действия и области применения / под ред. С.Г. Фаттахова. Казань: Печать Сервис ХХI век, 2014 С Дорошенко, Н.П. Препарат мелафен в культуре винограда in vitro / Н.П. Дорошенко, Т.В. Жукова // Научное наследие Я.И. Потапенко основа современной науки о винограде и вине: материалы международной научно-практической конференции, посвященной 110-летию со дня рождения Я.И. Потапенко. Новочеркасск, С

Способ длительного беспересадочного хранения растений винограда в культуре in vitro

Владельцы патента RU 2708840:

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ длительного беспересадочного хранения растений винограда в культуре in vitro, включающий микрочеренкование пробирочных растений с 8÷10 междоузлиями на фрагменты длиной 10÷12 мм с глазком и листом, посадку и их культивирование на твердой питательной среде Мурасиге и Скуга, в которую добавляют антибиотик гентамицин в концентрации 0,005-0,9 мл/л, что позволяет продлить срок беспересадочного хранения, при снижении энергозатрат и упрощении технологического процесса. Изобретение позволяет увеличить продолжительность культивирования растений без пересадок до 8-12 месяцев, что вдвое больше по сравнению с ближайшим аналогом изобретения. 4 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии растений и виноградарству и может быть использовано для длительного беспересадочного хранения ценных и редких сортов винограда в условиях in vitro, в исследованиях по физиологии винограда. Служит охране окружающей среды.

Методы культивирования in vitro позволяют создать биотехнологию поддержания и хранения генофонда при замедленном росте этих объектов. Насущной необходимостью является обеспечение коллекций материалом, находящимся под угрозой исчезновения.

При хранении коллекций in vitro в оптимальных условиях роста растений (t=20-23°С), возникает необходимость частого переноса микрорастений на свежую питательную среду, что повышает стоимость хранения образца и увеличивает риск его инфицирования различными микроорганизмами. Кроме того, частое пассирование микропобегов стимулирует активное деление клеток, что может способствовать возникновению сомаклональных вариантов. Для увеличения интервала между пассажами используют различные методы и приемы, основанные на замедлении роста пробирочных растений.

Известен способ, в котором замедление роста культур осуществляется снижением температуры культивирования. (Хранение коллекции винограда in vitro при пониженной температуре. Н.П. Дорошенко и др. Виноград и вино России, 1994, N 3, с. 24).

Недостатком способа является то, что для его осуществления необходимы холодильные камеры и большие затраты электроэнергии на их круглосуточную работу.

Известен способ депонирования растений винограда «Способ длительного сохранения in vitro растений винограда» (патент RU №2110172). Ограничение роста растений достигают за счет питательной среды, в состав которой вводят тонкоизмельченные семена винограда в таком количестве, что они являются естественными ингибиторами роста.

Недостаток этого способа заключается в том, что суммарное количество ингибиторов (абсцизовой и хлорогеновой кислот, фенолов, рутина, свободных ауксиов и цитохининов) колеблется в зависимости от сортовых особенностей, времени сбора и продолжительности срока хранения семян. Для уточнения концентраций добавляемых семян и увеличения сроков беспересадочного хранения растений необходимо предварительное проведение большого количества сложных анализов.

Известен способ длительного хранения in vitro растений осины (патент RU 2522823). Повышение сохранности микрорастений осины достигалось в условиях in vitro при хранении при +4°С, использовании оптимальных концентраций минеральных и органических компонентов питательной среды, и изменения режима освещения (длительность и интенсивность).

Предложен довольно сложный и затратный способ хранения, включающий пониженную положительную температуру, применение осмотиков, изменение режима освещенности. Показана 100,0% сохранность растений, но не приведены данные о состоянии растений после длительного хранения растений в течение одного года.

Для деконтаминации питательной среды применяют антибиотики из группы аминогликозидов с широким спектром действия. Их недостаток – высокая токсичность. Следовательно, надо подобрать оптимальную концентрацию, чтобы элиминировать бактерии, не повреждая растения. При проведении антибактериальной хемотерапии с применением антибиотиков отмечается замедление роста растений, что позволяет использовать антибиотики для «минимализации роста» при создании коллекции генофонда винограда in vitro.

Однако, все рассмотренные способы хранения in vitro растений, обладают сложным технологическим процессом, требуют значительных энергозатрат и не обеспечивают защиты от микоплазменной инфекции, что сокращает продолжительность беспересадочного хранения.

Задачей данного изобретения является, разработка способа длительного беспересадочного хранения in vitro редких и ценных сортов винограда при создании генетического банка стерильных культур, позволяющего продлить срок беспересадочного хранения, при снижении энергозатрат и упрощении технологического процесса за счет защиты от бактериальной инфекции и замедления ростовых процессов растений.

Поставленная цель достигается тем, что в способе длительного беспересадочного хранения растений винограда в культуре in vitro, включающем микрочеренкование пробирочных растений с 8÷10 междоузлиями на фрагменты длиной 10÷12 мм с глазком и листом, посадку и их культивирование осуществляют на твердой питательной среде Мурасиге и Скуга с добавлением в ее состав антибиотика гентамицин в концентрации 0,005÷0,9 мл/л.

Преимущество данного способа заключается в том, что в результате применения гентамицина, можно решить две проблемы: оздоровление от бактериальной инфекции и замедление ростовых процессов растений с целью их более продолжительного беспересадочного хранения при снижении энергозатрат и упрощении технологического процесса.

Анализ известных способов хранения микрорастений в коллекции in vitro, проведенный по научно-технической и патентной документации, показал, что применение антибиотиков для создания коллекции растений винограда неизвестно из уровня техники, следовательно, он соответствует такому условию патентоспособности изобретения, как новизна

Новым в предложенном способе является то, что микрочеренки пробирочных растений высаживают на твердую модифицированную питательную среду Мурасиге и Скуга с уменьшенным содержанием макросолей, витаминов и индолилуксусной кислоты, с добавлением в состав питательной среды антибиотика гентамицин широкого спектра действия, относящегося к группе аминогликозидов, в концентрации 0,005 – 0,9 мл/л.

Гентамицин быстро проникает сквозь клеточную мембрану микроорганизмов, успешно соединяется с субъединицей рибосом клеток микроорганизмов, что блокирует синтез белка, препятствуя образованию комплекса транспортной и информационной РНК, при этом происходит ошибочное считывание РНК и образование нефункциональных белков. Гентамицин обладает бактерицидным действием – в больших концентрациях снижает барьерные функции цитоплазматических мембран, вызывает гибель микроорганизмов и оказывает антисептическое влияние по отношению большинства грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе на мутированных микробов, приспособившихся к другим антибиотикам.

Способ осуществляется следующим образом.

Отбирают растения винограда, регенерированные из апикальных меристем размером 0,1÷0,2 мм и размноженные в культуре in vitro. Растения должны иметь 8÷10 междоузлий. Затем приступают к приготовлению твердой питательной среды Мурасиге и Скуга следующего состава, мг/л: макро-элементы-аммоний азотнокислый-NH₄NO₃-138, калий азотнокислый-KNO₃-950, -магний сернокислотный -MgSO₄7H₂O-185, калий фосфорнокислый однозамещенный-KH₂PO₄ -68, кальций хлористый 2-водный-CaCl₂ 2H₂O-296; микроэлементы-борная кислота-H₃BO₃-6.2, марганец сернокислый 4-водный -MnSO₄4H₂O-22.3; медь сернокислая 5-водная-CuSO₄ 5Н₂-0.025, кобальт хлористый 6-водный-CoCl₂ 6H₂O-0.025; цинк сернокислый 4-водный-ZnSO₄4H₂O-8.6, натрий молибденовокислый 2-водный-Na₂MoO₄ 2H₂O-0.25, калий иодистый-KJ-0.86, хелат железа: железо сернокислое 7-водное-FeSO₄ 7Н₂O-27.8, трилон-Б-Na₂ЭДТА-37.3; витамины-мезоинозит-50, тиамин HCl-0,2; ИУК-0,1-3 мг/л; рН среды перед автоклавированием 5,7-5,9.

Гентамицин добавляют в твердую питательную среду после автоклави-рования. В боксе после остывания до +55°С ее разливают в стерильные пробирки.

Микрочеренкование осуществляют в операционной комнате в ламинарном боксе «Фортран». Побеги, имеющие 8÷10 междоузлий, при помощи пинцета извлекают из пробирки, помещают на стерильную чашку Петри, разрезают на микрочеренки, имеющие глазок с листом. Длина микрочеренка 10÷12 мм, 2 мм над глазком остальные под глазком. Полученные микрочеренки высаживают на твердую питательную среду по одному в пробирку. Культивирование осуществляют в культуральной комнате при освещенности 2,0÷3,0 тыс.люксов, фотопериоде – 16 часов, температуре 25÷27±2°С, влажности воздуха 70÷75%.

Проведена серия опытов на различных сортах винограда при добавлении в состав питательной среды антибиотика гентамицин.

Результаты влияния на сорт Феркаль антибиотика гентамицин в концентрациях 0,1;0,3 и 0,5 мл/л в составе питательной среды на этапе микрочеренкования приведены в Табл. 1.

Во-первых, следует отметить, что гентамицин способствовал улучшению приживаемости микрочеренков и регенерации растений. Приживаемость и сохранение растений при введении его в состав питательной среды превышала эти показатели растений в контрольном варианте в 2÷3 раза.

Скорость роста растений при применении гентамицина снижалась, и ухудшались их ростовые характеристики. Эти отрицательные явления наиболее существенно проявились при концентрациях 0,3÷0,5 мл/л. При концентрации 0,1 мл/л, несмотря на замедление роста, происходило удовлетворительное развитие как ризогенной зоны, так и побега, растения имели здоровый вид.

Результаты влияния на сорт Феркаль антибиотика гентамицин в концентрациях 0,05; 0,1; 0,2 и 0,3 мл/л в составе питательной среды на этапе микрочеренкования приведены в Табл. 2.

Также подтвердилось положительное влияние гентамицина на оздоровление от микозов, что способствовало повышению приживаемости микрочеренков и развитию их в растения. Через 45 дней культивирования приживаемость в контрольном варианте составила 40,5%, а при введении в состав питательной среды гентамицина 95,0÷97,6%. Как и в первом опыте проявилось токсическое влияние антибиотика на образование и рост корней, рост побегов и образование, и рост листьев. Менее всего пострадали от гентамицина растения при минимальной концентрации 0,05 мл/л. При продолжительном культивировании они незначительно отличались по размерным характеристикам от контрольных растений, но имели более здоровый, жизнеспособный вид.

Динамика состояния растений аборигенных сортов винограда при хранении в коллекции in vitro на питательной среде с гентамицином приведены в Табл. 3.

Как видно из приведенных данных продолжительность хранения растений сорта Красностоп золотовский без пересадок составила 4÷11 месяцев. В начале хранения увеличивалась высота растений, происходило образование новых листьев, а затем происходило постепенное их усыхание, усыхание побегов, снижение коэффициента жизнеспособности и гибель растений. Однако отдельные растения сохраняли жизнеспособность длительное время. Лучшие показатели отмечены у растений при хранении их в течение 4÷6 месяцев, коэффициент жизнеспособности в это время равнялся 2,5÷2,8 баллов. После 7-ми месяцев жизнеспособность снижалась до 1,3÷1,8 баллов. После 10÷11 месяцев оставались жизнеспособными единичные экземпляры.

При депонировании сорта Цимлянский черный (клон 1-3-13-2-3) выявлена возможность беспересадочного хранения растений в течение 10÷14 месяцев при удовлетворительном коэффициенте жизнеспособности. При этом сохраняется достаточное количество растений и зеленых листьев, благодаря чему можно провести регенерацию растений и их дальнейшее микроразмножение.

Для растений сорта Сыпун черный характерен интенсивный рост. В течение первых 3÷4 месяцев хранения наблюдается торможение роста, высокая жизнеспособность растений. После 8-ми месяцев культивирования происходит интенсивный рост растений, высыхание питательной среды и, как следствие, высыхание растений. Но, тем не менее, отдельные экземпляры сохраняются в жизнеспособном состоянии более одного года.

При продолжительности хранения растений сорт Каберне Совиньон в течение 15 месяцев на питательной среде с гентамицином сохранилось единичные растения: 2 в варианте с содержанием гентамицина 0,005 мл/л и 1 растение в варианте с концентрацией 0, 01.мл/л.

Продолжительность хранения растений сорта Золотинка на питательной среде с гентамицином составила 13 месяцев. В контроле (без ГМ) сохранилось 1 растение, при концентрации ГМ 0,03 мл/л – 6 растений, при концентрации 0,05 мл/ л – 9 растений.

Последействие длительного хранения растений на питательной среде с различными концентрациями гентамицина на примере сорта Каберне Совиньон представлено в Табл. 4.

Установлено, что продолжительное культивирование на питательной среде с гентамицином не оказывает отрицательного влияния на последующую регенерацию растений и интенсивность у них ростовых процессов. При этом выявлена возможность хранения растений без пересадок в течение 8-12 месяцев. Несмотря на ослабление растений в процессе хранения, пожелтение листьев, их увядание установлено, что они сохранили жизнеспособность и обеспечили при пересадке хорошую регенерационную способность. Помимо этого, отмечено улучшение показателей развития растений в вариантах с антибиотиком. На 75-й день культивирования растения в вариантах с гентамицином превосходили контрольные растения по длине корней и ризогенной зоны, по высоте растений и облиственности.

Способ длительного беспересадочного хранения растений винограда в культуре in vitro, включающий микрочеренкование пробирочных растений с 8÷10 междоузлиями на фрагменты длиной 10÷12 мм с глазком и листом, посадку и их культивирование осуществляют на твердой питательной среде Мурасиге и Скуга, отличающийся тем, что в питательную среду добавляют антибиотик гентамицин в концентрации 0,005-0,9 мл/л.

Источники:

http://vinograd.info/stati/stati/vliyanie-pitatelnyh-sred-na-prodolzhitelnost-kultivirovaniya-podvoynyh-rasteniy-vinograda-v-usloviyah-in-vitro.html
http://docplayer.ru/28893679-Sozdanie-i-hranenie-kollekcii-vinograda-in-vitro.html
http://findpatent.ru/patent/270/2708840.html