Обмен азотистых веществ при брожении

Изменение азотистых веществ при брожении

Довольно резкие изменения происходят во время главного брожения в составе веществ сусла. Значительно сокращается общее количество белка, а также отдельных его фракций.

Здесь происходят два процесса, снижение количества азотистых веществ вследствие потребления их в процессе брожения, а частично за счет образования белководубильных компонентов, выпадающих из сусла вследствие понижения pH, накопления спирта и некоторых других факторов, и повышение содержания азотистых веществ за счет выделения их дрожжевыми клетками.

Приблизительно 50% азота, содержащегося в сусле, усваивается дрожжами, и пиво в результате брожения содержит около 50% общего количества азота сусла и около 16,5% азота, выделенного дрожжами. Дрожжи могут ассимилировать все аминокислоты, но некоторые из них предпочтительно.

К азотистым соединениям, которые усваиваются дрожжами в большей степени, чем другие, относятся аспарагиновая кислота, аспарагин, серин и треонин. Напротив, г-аминомасляная кислота, аланин, глицин и тирозин утилизируются только частично во время главного брожения, но при дображивании использование их повышается.

Сбраживание сусла сопровождается изменением кислотности – нарастанием концентрации водородных ионов. Величина pH быстро снижается в результате образования углекислоты и некоторых органических кислот и в конце главного брожения находится в пределах 4,3-4,5.

Буферная фосфатная система сусла (первичный – вторичный фосфаты) во время брожения усиливается за счет введения углекислых солей и солей органических кислот. В пиве имеются следующие буферные системы: первичный фосфат – бикарбонат – угольная кислота и органические кислоты – соли органических кислот. pH пива вне зависимости от начального pH сусла (в пределах 0,2-0,4) устанавливается примерно на одинаковом уровне. Это положение обусловлено тем, что при более низком pH в сусле распад белков протекает полнее и количество буферных веществ в нем больше. При более высоком pH протеолитический гидролиз происходит слабее и буферных веществ накапливается меньше. Кислотам, образующимся при брожении, сдвинуть pH труднее, поэтому разница в величине pH сусла и пива в этих условиях уменьшается.

Снижение pH во время брожения сопровождается осветлением пива.

Происходит выделение и выпадение некоторых фракций белков с одновременным оседанием дрожжей. Осаждается при этом и та часть холодного бруса сусла, которая, хотя бы и в небольшом количестве, перешла с суслом в бродильный чан.

Дрожжевые клетки при переносе их в сусло обволакиваются слизистой пленкой, имеющей в основном белковый характер и содержащей, кроме того, дубильные вещества, нерастворимые кальциевые соли, кремневую кислоту и гуммиобразные вещества. Эта слизистая пленка может растворяться протеиназой дрожжей. Если протеиназа недостаточно активна, дрожжевые клетки благодаря наличию слизистой оболочки собираются в крупные агрегаты, которые оседают на дно чана.

Если же протеиназа достаточно активна и растворяет белки слизистой оболочки, дрожжи длительное время остаются во взвешенном состоянии. У некоторых дрожжей указанное состояние является нормальным, поэтому различают оседающие, хлопьевидные, легко агглютинирующие дрожжи (типа Заад) и дрожжи пылевидные (типа Фроберг). Первые из них сбраживают сусло относительно неглубоко, вторые же благодаря тому, что находятся во взвешенном состоянии длительный период времени, обладают высокой сбраживаемостью.

Осветление пива, сброженного хлопьевидными дрожжами, происходит иногда в бродильном чане, и пиво перекачивается в лагерные танки уже более или менее прозрачным. Однако агглютинация зависит еще от ряда факторов. Известно, что дрожжи из аппаратов чистых культур не агглютинируют в достаточной степени при первой задаче их, так же ведут себя и хорошо промытые дрожжи, в особенности если они промыты щелочными растворами. Дрожжи должны привыкнуть к среде (состав сусла, его физические свойства).

Спирт в концентрации до 3% способствует агглютинации. В сусле содержатся вещества, задерживающие агглютинацию, однако имеются и вещества, которые способствуют ей, так что дрожжи оседают значительно раньше, чем они успевают выбродить сусло до нужного предела. Это вещество, вызывающее преждевременное оседание дрожжей, содержится в солоде, и активность его усиливается при продолжительном затирании.

Вещество, выделенное из дробины при помощи кипящей воды, значительно усиливало процесс оседания дрожжей. Добавление в сусло такадиастаза предотвращало это явление, а добавление папаина не оказывало никакого действия, отсюда был сделан вывод, что это вещество имеет углеводный характер и является каким-то полисахаридом, вероятно, относящимся к гуммиобразным веществам.

Изменение концентрации водородных ионов при брожении связано с процессом размножения дрожжей;чем быстрее происходит размножение, тем быстрее увеличивается кислотность. Таким образом, эти оба момента способствуют образованию хлопьев и тем самым понижают сбраживание. Наоборот, чем медленнее происходит процесс размножения дрожжей и нарастание кислотности, тем позднее наступает оседание и тем выше сбраживаемость. Изменение кислотности пива сопровождается выделением ряда веществ, растворимость которых зависит от реакции среды, в частности горьких веществ хмеля. Кроме того, происходит выделение белков в виде крупных агрегатов, а также агглютинация и оседание дрожжевых клеток. Образующиеся скопления обладают большой адсорбционной поверхностью, они способны частично увлекать при осаждении хмелевые вещества.

Изменение состава сусла в процессе брожения

Спиртовое брожение виноградного сусла связано с превра­щениями не только усвояемых углеводов и аминокислот, но и всех основных групп веществ: органических кислот, фенольных соединений, эфирных масел, азотистых и минеральных веществ.

Сахара. Они почти отсутствуют в сухих столовых винах, а остаточный сахар (1,5—2,5 г/л) состоит главным образом из несбраживаемых пентоз. В других типах вин в зависимости от сте­пени сбраживания сахаров остается больше. Пектиновые веще­ства распадаются. Остаются несбраживаемые сахара (пентозы) и часть полисахаридов.

Органические кислоты. Определяя величину рН, они регули­руют интенсивность и направленность биохимических реакций внутри дрожжевой клетки. В процессе брожения происходит так­же превращение кислот, как содержащихся в сусле, так и обра­зованных при брожении. Дрожжи способны окислять уксусную, янтарную и лимонную кислоты по циклу ди- и трикарбоновых кислот.

Вместе с тем с помощью изотопа углерода доказано, что винные дрожжи в определенных условиях превращают пировиноградную кислоту в уксусную, а также синтезируют из амино­кислот и углеводов янтарную, молочную, яблочную, глиоксалевую, фумаровую, галактуроновую и другие кислоты. Изменение титруемой кислотности определяется ее первоначальным значе­нием в сусле. При высокой кислотности сусла (низкий рН) она снижается в процессе брожения, а при низкой кислотности — повышается.

Количество летучих кислот возрастает в анаэробных услови­ях и уменьшается при брожении сусла в присутствии кислорода. В процессе брожения выпадают в осадок кальциевые и кислые калиевые соли винной кислоты, растворимость которых умень­шается с повышением концентрации спирта.

Фенольные соединения. Они также претерпевают значитель­ные изменения. В начале брожения, когда в сусле имеется кис­лород, фенольные вещества окисляются и дают продукты, об­условливающие покоричневение; часть хинонов, образуя димеры, выделяется из раствора. Во время брожения наблюдается вос­становление хинонов за счет глютатиона дрожжей; цвет бродя­щего сусла или забродившей мезги светлеет.

Кроме того, фенольные вещества вступают в реакцию с бел­ками и выпадают в осадок; образуют комплексные соединения с железом, ацетальдегидом, ингибируют микроорганизмы. В процессе брожения сусла на мезге в связи с повышением спиртуозности среды усиливается экстрагирование фенольных ве­ществ, в том числе антоцианов и нефлавоноидных ароматиче­ских фенолокислот. Брожение сусла на мезге за счет фенольных веществ, придает особый аромат и вкус винам.

Минеральные вещества. При спиртовом брожении сусла они интенсивно потребляются дрожжами: примерно 20—30 % их переходит в дрожжевую массу. Часть минеральных веществ, свя­зывает свободные кислоты сусла, увеличивая его нетитруемую кислотность или выпадая в осадок.

Содержание кальция может возрастать после обработки сусла мелом, при использовании плохо обработанных железобетонных резервуаров. Количество сульфатов может увеличиваться вследствие окисления сернистой кислоты, при обработке гипсом мезги или обработке бетон­ной поверхности резервуаров серной кислотой.

Микроэлементы. Их присутствие в виноградном сусле необ­ходимо для питания дрожжей; они используются дрожжевыми клетками для синтеза витаминов и ферментов, участвуют в бел­ковом обмене.

Азотистые вещества. Подвергаются при брожении сусла наи­большим изменениям. Дрожжевые клетки ассимилируют от 30 до 50 % имеющегося азота, в первую очередь легкоусвояемые формы: соли аммония и аминокислоты. В период брожения вы­сокомолекулярная фракция азотистых веществ осаждается об­разующимся спиртом. Выпадают в осадок и танно-белковые комплексы.

Установлено, что при аэрации сусла потребление азотистых веществ дрожжами возрастает. С повышением температуры бро­жения накапливается биомасса дрожжей, увеличивается вынос азотистых веществ из сусла.

К концу брожения начинается отмирание части дрожжевых клеток и вслед за этим наступает их автолиз (разложение). При пониженных температурах автолиза (10—20°С) вино обогащается аминокислотами, витаминами, ферментами, липидами дрожжей, веществами аромата (эфиры, терпеноиды, жирные кислоты). При температурах, способствующих развитию бактерий (25—30°С), происходит бактериальное разложение азотистого комплекса отмерших дрожжей, аромат и вкус вина ухудшаются вплоть до появления посторонних то­нов.

Ароматические вещества. В составе ароматических веществ сусла, насчитывающих более 300 наименований, при брожении происходит резкая перестройка состава.

Дрожжевые клетки на стадиях размножения и логарифмического роста потребляют терпеновые соединения, но выделяют набор высших алифатических и ароматических спиртов (3-фенилэтанол, тирозол) и сложных эфиров, изменяющих аромат сусла: вместо ярких терпеновых ароматов сорта появляются сильные тона розы, цветов липы, акации, меда, свойственные ароматическим спиртам и их слож­ным эфирам. Фруктово-цветочный запах имеют этиловые эфиры масляной кислоты и ее гомологов. Так формируются цветочные тона столовых вин.

При высоких температурах брожения, приятно пахнущие ком­поненты улетучиваются, а при хранении в условиях доступа кис­лорода воздуха — необратимо окисляются. Поэтому на стадии брожения сусла и формирования виноматериалов необходимо соблюдать постоянную герметизацию, удаляя избыток СО2.

На образование веществ аромата, букета вина положительно влияет смена рас дрожжей, что широко используется в класси­ческом итальянском и французском виноделии.

Витамины и ферменты. Изменение витаминного состава сус­ла определяется расой дрожжей и условиями брожения. В пер­вый период брожения большинство витаминов сусла поглощает­ся дрожжами, затем дрожжевые клетки начинают сами синте­зировать витамины биотин, никотинамид, пиридоксин и др. На заключительном этапе формирования виноматериалов и выдержке вина на дрожжах происходит переход витаминов в вино.

При брожении сусла инактивируются окислительные фер­менты, а в стадии голодания дрожжи выделяют в среду протеиназу, β-фруктофуранозидазу и другие ферменты. Избыточная сульфитация сусла перед брожением, обработка бентонитом и другими сорбентами значительно обедняют вино полезными ви­таминами и ферментами.

Метаболизм азотистых веществ

Для размножения дрожжей и необходимого для этого строительства нового клеточного вещества дрожжам требуется азот. В начальной фазе брожения низкомолекулярные пептиды гидролизуются и утилизируются дрожжами. Во время основной стадии брожения главный, но не единственный источник азота составляют аминокислоты. Дипептиды перерабатываются медленнее, чем аминокислоты. В конце брожения даже при наличии аминокислот вновь начинается ассимиляция пептидов. Аминокислоты важны не только для биосинтеза протеинов дрожжей, но и для образования пермеаз и других ферментов. В сусле для создания необходимых условий для размножения дрожжей и протекания брожения в нужном направлении должно содержаться достаточное количество аминокислот и пептидов.

3.2.2.1. Усвоение аминокислот дрожжами происходит с помощью пермеаз в определенной последовательности. Через некоторое время, за которое дрожжи потребляют половину количества каждой аминокислоты, их можно разделить на четыре группы:

· группа А: глютаминовая и аспараги-новая кислоты, аспарагин, глютамин, се-рин, треонин, лизин, аргинин;

· группа Б: валин, метионин, лейцин, изолейцин, гистидин;

· группа В: глицин, фенилаланин, тирозин, триптофан, аланин, аммиак;

· группа Г: пролин.

Если первые три группы абсорбируются довольно быстро, то пролин дрожжи практически не усваивают. Деление на эти группы действует для дрожжей верхового брожения; для дрожжей низового брожения хотя и имеет место аналогичное распределение аминокислот по группам, в исследованных дрожжах выявлено более позднее усвоение валила и гистидина и наблюдается нестабильное поведение аргинина.

На последовательность усвоения аминокислот оказывают влияние системы пермеаз. Первоначально усвоенная универсальная аминокислота пермеаза (УАП) во время первой стадии брожения еще не синтезируется, так как в сусле еще присутствуют ионы аммония. Аминокислоты группы А и, вероятно, группы Б характеризуются более специфичными транспортными системами, чем УАП. После усвоения ионов аммония из сусла образуется УАП, и все аминокислоты за исключением одной аминокислоты группы Г (пролина) усваиваются по этой транспортной системе дрожжевой клеткой. Выяснилось, однако, что на эффективность абсорбции аминокислот пермеазами влияет состав жирных кислот фосфолипидов в мембране цитоплазмы дрожжевой клетки. Этот состав жирных кислот в ходе брожения изменяется, причем отсутствие кислорода способствует строительству клеточных мембран со все увеличивающейся долей остатков насыщенных жирных кислот, которые при наличии ненасыщенных жирных кислот сусла также потребляются для строительства клеточных стенок. При их дефиците эффективная аэрация может даже вызвать синтез ненасыщенных кислот из насыщенных.

Процесс усвоения аминокислот во время брожения таким образом проходит многопланово, однако при брожении потребление аминного азота зависит не столько от содержания какой-либо отдельной аминокислоты, а скорее от общего содержания ассимилируемого азота.

3.2.2.2. Вместе с тем значение отдельных аминокислот важно и само по себе. Аминокислоты в значительном объеме ассимилируются в ненарушенном состоянии, однако в результате трансаминировання дрожжами они преобразуются в такие аминокислоты, которые именно в этот момент времени наиболее необходимы для строительства клеточного белка. Для этого служат не только углеродные каркасы аминокислот, но и каркасы простых Сахаров, оксикислоты которых при окислительном метаболизме углеводов образуются как промежуточные продукты реакции (например, α-кетоглутаровая кислота в фазе 15 дает глютаминовую кислоту, щавелево-уксусная кислота – аспарагиновую, а пировиноградная кислота – аланин). В связи с этим одни аминокислоты, α-кетокислоты которых важны для синтеза аминокислот, должны присутствовать в достаточном количестве, тогда как другие, несмотря на их вклад в содержание общего ассимилируемого азота, не столь важны. Лизин, гистидин, агринин и лейцин продуцируют оксикислоты, которые могут ассимилироваться только определенными аминокислотами субстрата. Нехватка этих аминокислот может изменить белковый обмен дрожжей и отрицательно повлиять на качество пива. Концентрация изолейцина, валина, фенилаланина, глицина, аланина и тирозина в сусле важна из-за того, что на более поздних стадиях брожения подавляется синтез Сахаров из акетокислот.

При этом они должны извлекаться из углеродного каркаса соответствующих аминокислот. С другой стороны, слишком низкое их содержание может отрицательно влиять на качество пива. Третья группа аминокислот для метаболизма дрожжей имеет небольшое значение: аспарагиновая к и с л о т а , глютаминовая кислота, аспарагинн, глютамин, треонин, серии и метионин на первых стадиях брожения извлекаются преимущественно из углеродных каркасов аминокислот, а на последней стадии – из кетокислот Сахаров.

К этой группе можно отнести и пролин, так как его концентрация большого значения не имеет.

Дефицит указанных групп аминокислот проявляется в усиленном использовании α-кетокислот углеводного метаболизма. Оксикислоты, высвобождающиеся при этом путем дезаминирования аминокислот, декарбоксилируют в альдегид, который имеет на один атом углерода меньше, чем первоначальная кетокислота, и затем восстанавливаются до спирта (механизм Эрлиха). Это приводит к увеличению содержания высших спиртов и тем самым оказывает влияние на качество пива (см. раздел 7.4.2.2). Избыток аминокислот также вызывает усиленное образование побочных продуктов (см. раздел 3.2.6).

3.2.2.3. Метаболизм азотистых веществ при брожении. В 12 %-ном сусле, приготовленном только из солода, содержится около 1000 мг азота/л. Несоложеное сырье (рис и кукуруза) вызывает снижение содержания азота, причем около 60 % приходится на долю низкомолекулярного азота; α-аминный азот составляет 20-23 %, то есть в сусле из соложеного зерна – 200-260 мг/л.

Снижение содержания азота при нормальном брожении составляет 250-320 мг/л, и таким образом в пиве, как правило, остается еще от 680 до 750 мг/л азота. Основное снижение содержания азота происходит вследствие его усвоения дрожжами, включающего не только α-аминный азот, но и низкомолекулярные пептиды. Содержание осаминного азота уменьшается на 100-120 мг/л. Из-за снижения значения pH в ходе брожения 50-70 мг высокомолекулярных азотистых веществ/л выпадают в осадок, адсорбируются на поверхности дрожжей или захватываются пузырьками углекислого газа и переходят шапку пены (деку). Дрожжи, однако, не только потребляют азотистые вещества, но и вновь выделяют часть из них в виде аминокислот и пептидов. С учетом этого количества азота дрожжи перерабатывают около 40 % азота сусла.

Метаболизм жиров

Липиды дрожжей вместе с белком образуют клеточные мембраны дрожжей. При этом речь идет о фосфолипи-дах, стеринах (эргостерине, цимостерине), гликолипидах и др. Липиды составляют около 80 % CB клеточных стенок. Так как масса дрожжей во время брожения увеличивается в 4 – 6 раз, то наряду с белком должны быть синтезированы и липиды, для чего требуется молекулярный кислород.

3.2.3.1. Образование жирных кислот начинается с активирования уксусной кислоты, образующейся при окислительном декарбоксилировании пирувата. Путем конденсации ацетилкоА и нескольких молекул малонилкоА в процессе синтеза жирных кислот образуются насыщенные жирные кислоты. Ненасыщенные жирные кислоты образуются путем дегидрирования насыщенных жирных кислот с одинаковой длиной цепочек при участии НАДФ H₂ и молекулярного кислорода. При этом возможно формирование только одной двойной связи (между 8-м и 9-м атомами углерода). На синтез жирных кислот положительно влияют фосфаты, магний, биотип и пантотеновая кислота.

3.2.3.2. Значение жирных кислот в метаболизме дрожжей. Высокомолекулярные ненасыщенные жирные кислоты, присутствующие в клеточной стенке в виде липидов, в частности стерин (например, эргостерин), способствуют усвоению питательных веществ в растворенной или диспергированной форме. При недостатке таких липидов поглощение аминного азота становится невозможным, даже если в сусле содержится достаточное количество аминокислот. Транспортировка фосфата через клеточную мембрану также зависит от содержания в ней липидов. Кроме того, ненасыщенными жирными кислотами активируются важные для реакций фосфорилирования АТФ-ферменты. Таким образом, липиды в той или иной степени важны для основного пути расщепления глюкозы по схеме Эмбдена-Мейергофа-Парнаса.

Существенное влияние жирных кислот на процессы, происходящие во время брожения, свидетельствует о том, что в клетке должно присутствовать некоторое минимальное число ненасыщенных высокомолекулярных жирных кислот. Они могут быть внесены с суслом, что, однако, в последующем вызывает проблемы со стабильностью вкуса пива. Стимулировать синтез этих жирных кислот необходимо за счет хорошего снабжения кислородом в начале брожения.

В сусле также присутствуют насыщенные и ненасыщенные среднемолекулярные жирные кислоты (C₆-C₁₂). Они также участвуют в процессе метаболизма дрожжей, причем С₂-фрагмеиты используются через ацетил-коА и малонил-коА для синтеза высокомолекулярных жирных кислот.

3.23.3. Жирные кислоты и образование сложных эфиров. Образование сложных эфиров в ходе брожения (см. раздел 3.2.6.2) может подавляться повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот в сусле. С их помощью образуется больше клеточной массы дрожжей, что обусловливает утилизацию богатых энергией соединений в виде кофермента А, которого затем не хватает для образования сложних эфиров. В некоторых условиях, однако, насыщенные кислоты могут оказывать обратное действие – например, стеариновая и пальмитиновая кислоты в форме коА-комплексов способны выступать в качестве ингибитора синтеза жирных кислот. Ненасыщенные жирные кислоты снижают также образование среднемолекулярных жирных кислот (по-видимому, этот механизм сходен с вышеописанным).

3.2.3.4. Синтез глицерина основан на расщеплении углеводов (схема Эмб-дена-Мейергофа-Парнаса, фаза 4). Образующийся при этом диоксиацетонфосфат восстанавливается с помощью НАДН в глицеринфосфат и фосфоэстеразой переводится в глицерин. Глицерин, образующийся при расщеплении жиров, наоборот, вводится в анаэробный углеводный обмен. Свободные жирные кислоты окисляются до CO₂ и воды, однако степень этой реакции зависит от степени расщепления углеводов.

Источники:

http://studwood.ru/1759654/tovarovedenie/izmenenie_azotistyh_veschestv_brozhenii
http://vinocenter.ru/izmenenie-sostava-susla-v-processe-brozheniya.html
http://lektsii.org/4-8252.html