Биотехнология криосохранения семян и протокормов орхидей

научная статья по теме КРИОСОХРАНЕНИЕ СЕМЯН И ПРОТОКОРМОВ РЕДКИХ ОРХИДЕЙ УМЕРЕННОГО КЛИМАТА Биология

Цена:

Авторы работы:

Научный журнал:

Год выхода:

Текст научной статьи на тему «КРИОСОХРАНЕНИЕ СЕМЯН И ПРОТОКОРМОВ РЕДКИХ ОРХИДЕЙ УМЕРЕННОГО КЛИМАТА»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИИ, 2007, том 54, № 1, с. 137-143

КРИОСОХРАНЕНИЕ СЕМЯН И ПРОТОКОРМОВ РЕДКИХ ОРХИДЕЙ УМЕРЕННОГО КЛИМАТА

© 2007 г. Т. В. Никишина*, Е. В. Попова*, М. Г. Вахрамеева**, Т. И. Варлыгина**, Г. Л. Коломейцева***, А. В. Буров****, Е. А. Попович*,

А. И. Широков****, В. Ю. Шумилов *, А. С. Попов*

*Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва **Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва ***Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук, Москва ****Центр реинтродукции редких видов и растительных сообществ, Н.-Новгород

Поступила в редакцию 21.03.2006 г.

Исследовали эффективность криосохранения семян 5 видов редких и исчезающих видов орхидей (родов Platanthera и Dactylorhiza) умеренной полосы с последующим асимбиотическим культивированием in vitro, а также культивируемых in vitro протокормов D. fuchsii. Всхожесть семян после их хранения в жидком азоте зависела от вида и могла быть как выше, так и ниже, чем у контрольных, не подвергавшихся замораживанию семян. Скорость роста протокормов (зародышей орхидных на начальной фазе развития после освобождения от семенной кожуры) из семян одних и тех же видов орхидей, собранных в разных областях России, достоверно не различалась в течение 5 мес. культивирования. После глубокого замораживания протокормов D. fuchsii размером 1200 мкм методом витрификации были получены живые протокормы, однако их рост запаздывал на 3 мес. по сравнению с контрольными протокормами.

Dactylorhiza – Platanthera – орхидеи – криосохранение семян и протокормов – культура in vitro

Крупнейшее (20000-35000 видов) сем. ОгсЫ-daceae Juss., несмотря на многочисленность и распространенность его представителей по всей нашей планете (за исключением полярной зоны), практически целиком включено в Красные книги разных стран, так как находится под угрозой вымирания [1]. Участники XVI Международного конгресса ботаников (США, 1999 г.) пришли к выводу, что из примерно 300000 видов высших растений, произрастающих в настоящее время на Земле, к середине нынешнего века может исчезнуть от 1/2 до 2/3. Если 18 лет назад из 123 видов орхидей в Российской Красной книге было 44, то в настоящее время в Перечень редких видов включено 66 видов (Приказ МПР РФ № 289 от 25.10.2005), и некоторым из них угрожает полное исчезновение [1].

Сокращения: ГСД – раствор криопротекторов для медленного замораживания; ДМСО – диметилсулфоксид; LS – нагружающий раствор (от Loading Solution); PVS2 – раствор для витрификации 2 (от Plant Vitrification Solution 2). Адрес для корреспонденции: Попов Александр Сергеевич. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18; электронная почта: cryo@ippras.ru

Причиной возникновения такой ситуации послужили, с одной стороны, уязвимость орхидей, которые имеют сложную биологию размножения – узкоспециализированное перекрестное опыление; облигатный симбиоз с мицелием гриба определенного вида, необходимый для прорастания микроскопических зародышей, лишенных запасных веществ; длительный цикл развития (до 17 лет). С другой стороны, мощный антропогенный пресс (уничтожение мест их обитания и др.) [2, 3]. Все орхидеи имеют очень декоративные цветки. Кроме этого, у многих орхидей умеренного климата подземные органы обладают целебными свойствами, что хорошо известно местному населению, которое активно их использует [4, 5]. Некоторые орхидеи, например, Dactylorhiza fuch-sii фгисе) Soo, содержат ценные лекарственные вещества, используемые при лечении различных заболеваний, в листьях [5, 6]. Этот вид распространен в северной половине Евразии, хотя повсюду очень редок. По сравнению с другими орхидеями он рано переходит к цветению – уже через 4-5 лет после посева семян, и способен существовать в культуре продолжительное время, гораздо дольше, чем другие виды рода Dacty-¡огЫ2а [7, 8]. На примере этого вида можно отрабатывать различные способы сохранения генофонда орхидей и преодолевать сложности,

Таблица 1. Состав среды Fast в модификации Бурова

Ca(NO3)2 ■ 4H2O KCl

160 80 80 160 80 16

Микроэлементы (по Хеллеру), мг/л MnS04 ■ 4H2O 0.1

CuSO4 ■ 5H2O 0.03

Al2(S04)3 ■ 18H2O 0.074

NiS04 ■ 7H2O 0.035

Органические добавки, г/л

Дрожжи пивные 2

Активированный уголь 2

неизбежно возникающие при работе с видами со слабо и трудно прорастающими семенами, т.е. он может быть использован как удобный модельный объект.

Сохранение орхидей в принципе возможно через культуру in vitro: для ряда видов уже разработаны способы асимбиотического проращивания семян, однако семена этих растений плохо хранятся даже в холодильнике [9-11]. Кроме того, поддержание коллекции in vitro очень трудоемко, и в процессе культивирования в растительном материале происходит накопление сомаклональных вариаций и непроизвольная селекция [12]. Выбор особей для дальнейшего культивирования обычно определяется по фенотипу, отбор же растений с определенным фенотипом неизбежно приводит к обеднению генофонда в целом. Поэтому, чем дольше поддерживается в культуре in vitro популяция, отобранная из гетерогенного посева, тем более гомогенной она становится [13].

Проблема надежного и неограниченно длительного хранения ортодоксальных семян с наименьшими затратами и на минимальной площади решается в криобанке (жидкий азот, -196°С). В 1979 г. для спасения исчезающих видов в дополнение к традиционным способам было предложено хранить семена, апексы, эмбриоиды и клетки, культивируемые in vitro и способные регенерировать растения, в жидком азоте [14]. Криобанки семян сельскохозяйственных культур и их дикорас-

тущих сородичей существуют в развитых странах уже около 40 лет.

Исследования криосохранения семян редких дикорастущих видов впервые в нашей стране начала Тихонова [15], и с 1986 г. ее коллекция находится в криобанке Института физиологии растений РАН [16-18]. Одновременно подобные исследования проводили Pritchard и др. на семенах некоторых орхидей [19, 20].

Влажность зрелых семян орхидных обычно менее 13%. Ранее мы успешно сохранили в криобанке семена редких тропических орхидей, прорастить которые в условиях in vitro оказалось легче, чем семена некоторых видов орхидей умеренного климата [11]. Наиболее быстро растущими из тропических видов оказались Calanthe vestita и Encyclia cochleata, полученные из семян, хранившихся в жидком азоте. После этого они уже цвели в оранжерее Главного ботанического сада РАН.

Цель данной работы состояла в том, чтобы разработать методику сохранения в криобанке семян и протокормов орхидей умеренной полосы, находящихся под угрозой исчезновения. Для этого проводили сравнительное изучение развития семян разной степени зрелости, собранных в разных регионах РФ, до и после глубокого замораживания.

В работе использовали зрелые семена Platan-thera bifolia (L.) Rich, а также зрелые и незрелые семена орхидей рода Dactylorhiza, собранные в различных регионах России: D. fuchsii (Druce) Soo -на Звенигородской биостанции МГУ (Московская обл.), недозрелые семена (сбор через 35-40 суток после опыления), в Костромской обл., незрелые семена (сбор через 27 суток после опыления) и в питомнике центра реинтродукции Нижегородского ГУ (Н.-Новгород), зрелые семена; D. maculata (L.) Soo – в Керженском заповеднике (Нижегородская обл.), на сфагновом болоте; D. baltica (Klinge) Orlova – в Минской обл. (Белоруссия); D. incarnata (L.) Soo – в питомнике центра реинтродукции (Н.-Новгород) и P. bifolia (L.) Rich. -в Рязанской обл., на влажной опушке леса и в питомнике центра реинтродукции (Н.-Новгород). До опытов свежесобранные семена хранили в холодильнике при 5-6°C в течение 2-3 мес. Влажность семян (D. fuchsii и D. incarnata) рассчитывали после их высушивания при 90°C в течение 3 суток.

Протокормы D. fuchsii культивировали около 7 мес. при 23 ± 1°С, 2.6 клк и фотопериоде 16 ч на агаризованной среде Fast в модификации Бурова (неопубликованные данные) (табл. 1) либо без регуляторов роста, либо с добавлением 0.1 или 1.0 мг/л бАп. Измеряли наибольший диаметр протокормов, число протокормов с апикальной

Таблица 2. Характеристика и всхожесть семян, собранных в разных регионах России

Вид растения Регион сбора семян Длина семени, мкм Длина зародыша, мкм Количество семян без зародышей, % Всхожесть семян на 60-е сутки, % Индекс роста**

Dactylorhiza fuchsii Костромская обл.* 936 ± 43 212 ± 8 15 60.0 19.5

(Druce) Soo Московская обл.* 600 ± 41 140 ± 10 40 40.3 19.3

Н.-Новгород 846 ± 20 208 ± 8 40 36.2 10.1

Platanthera bifolia Рязанская обл. 690 ± 26 180 ± 8 50 24.3 13.7

(L.) Rich. Н.-Новгород 713 ± 19 188 ± 6 45 48.9 16.0

** Индекс роста – отношение среднего диаметра протокормов к исходному диаметру зародышей на 150-е сутки культивирования.

почечкой и число почкующихся протокормов, а также длину ростков и диаметр псевдобульб.

Криосохранение семян. Зрелые семена замораживали в полиэтиленовых ампулах, быстро погружая их прямо в жидкий азот. Незрелые семена в данной работе не замораживали. Ампулы с семенами хранили в криобанке 30 суток. Оттаивание проводили в водяной бане при 40°С в течение 60 с. Перед посевом контрольные (не подвергавшиеся замораживанию) и опытные семена стерилизовали 5%-ным раствором гипохлорита кальция в течение 20-40 мин с последующей трехкратной отмывкой в дистиллированной воде по 5-15 мин. Нераскрывшиеся коробочки с незрелыми семенами протирали 70%-ным спиртом и обжигали в пламени спиртовки. Семена высевали в чашки Петри диаметром 9 см на агаризованную безгормональную среду МС [21] с половинной концентрацией макроэлементов, 20 г/л сахарозы, 0.7% агара, рН 5.5. Семена проращивали при 26 ± 1°С в темноте. Через 2-3 мес. подсчитывали образовавшиеся из зародышей протокормы, пересаживали их на свежую агаризованную среду того же состава и переносили в камеру с освещенностью 2.6 клк, фотопериодом 16 ч, температурой 25 ± 1°С и влажностью 70%.

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Пoхожие научные работы по теме «Биология»

ВАЛУЙСКИХ О.Е., ТЕТЕРЮК Л.В. — 2013 г.

ВЫСОЦКАЯ О. Н., ДОЛГИХ Ю. И., ПОПОВ А. С., СОЛОВЬЕВА А. И. — 2010 г.

ЗАГОСКИНА Н. В., МАРАКАЕВ О. А., НИКОЛАЕВА Т. Н., ЦЕЛЕБРОВСКИЙ М. В. — 2013 г.

ВЫСОЦКАЯ О.Н., ДОЛГИХ Ю.И., ПОПОВ А.С., СОЛОВЬЕВА А.И. — 2011 г.

Раздел “Культуры растительных клеток”

Методы сохранения генофонда

Методика криоконсервации, способы замедления роста

При получении клеточных линий с полезными признаками встает проблема сохранения этих признаков. Растения могут хранить генетическую информацию в семенах, однако этот источник не вполне надежен, так как со временем из-за мутаций всхожесть семян падает. Кроме того, некоторые растения размножаются только вегетативно. Этим обусловлена необходимость сохранения части материала in vitro. С другой стороны, в некоторых случаях удается получить новые клеточные линии, синтезирующие большее количество вторичных метаболитов, то есть более продуктивные, которые тоже нуждаются в сохранении.

Для исследования физиологических и биохимических процессов, протекающих в тканях, также требуются стандартные исходные культуры, чем вызвана необходимость сохранять материал в течение определенного промежутка времени, когда идут серийные эксперименты. Все это делает проблему сохранения генофонда весьма актуальной.

Можно, конечно, пассировать и перевивать клеточные культуры. Однако при этом возникает опасность сомаклональной изменчивости, накопления мутаций, контаминаций (заражения чужеродным генетическим материалом). Это также требует определенных финансовых и трудовых затрат (необходимость частых пересадок, расходы, связанные со средой и т.д.). Цель исследователей состоит в увеличении интервала между пересадками. Существует разные подходы к сохранению культур:

– сушка (распылительная и лиофильная) – для клеток микроорганизмов.

Криосохранение – замораживание при сверхнизких температурах. Обычно его проводят в жидком азоте, при температуре -196 o C.

Успех низкотемпературной консервации зависит от ряда факторов:

– вид и тип клеток,

– их концентрация в суспензии,

– состав среды для консервирования,

– вид и концентрация криопротектора,

– режим охлаждения и отогрева,

– способ реабилитации клеток после отогрева.

Существенную роль в успешном замораживании клеток играет их морфофизиологическое состояние: клетки, находящиеся в стационарной фазе роста, менее устойчивы к повреждающему действию низкотемпературной консервации, чем клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста. Клетки для замораживания отбирают в середине экспоненциальной фазы ростовой кривой.

Немаловажное значение имеет и плотность замораживаемой суспензии. Оптимальные результаты по восстановлению клеток были получены при замораживании клеточной суспензии плотностью 1*10 5 – 5*10 6 клеток в 1 мл.

Для растительных клеток часто требуется предварительное культивирование в особых условиях. В среду добавляют различные вещества, например:

• 2-6% маннит или сорбит для уменьшения размера вакуолей;
• аминокислоты, в первую очередь пролин, который служит для связывания воды в клетке (концентрация до 1 моля или 11,5%), аспарагин, γ-аминомасляную кислоту;
• диметилсульфоксид (ДМСО), который добавляют к среде для предкультивирования в концентрации от 2,5 до 10% на 48 часов для увеличения проницаемости цитоплазматической мембраны;
• кроме того, применяют искусственное закаливание к холоду, когда снижают температуру культивирования, имитируя естественный осенний процесс подготовки к периоду зимнего покоя (применим только для растений умеренного климата). Клеточные культуры выдерживают несколько суток при температуре +8 – +10 o C, а затем при +2 – +5 o C в течение 1 – 6 недель.

Процесс замораживания растительных клеток от животных отличает, в основном, наличие этапа предварительного культивирования.

Криопротекторы – вещества, позволяющие снизить повреждающее действие физико-химических факторов при криоконсервировании. К ним относятся сахароза, декстран, этиленгликоль, поливинилпирролидон, диметилсульфоксид (ДМСО), глицерин. Для определения токсичности криопротектора клетки выдерживают при комнатной температуре в различных его концентрациях в течение 30 – 50 минут, после чего определяют их жизнеспособность. Дополнительно оценивают его протективные свойства путем пробного замораживания и оттаивания культур. Наиболее часто в качестве криопротекторов используют глицерин и ДМСО. Перед добавлением криопротектора суспензию клеток концентрируют путем центрифугирования, надосадочную жидкость сливают. Криопротекторы вносят в культуру за час до замораживания, что приводит к изменению проницаемости мембраны, изменению точки замерзания и оттаивания.

Программы охлаждения могут быть различными, но для всех них характерна медленная скорость охлаждения. При замораживании происходит образование льда внутри и снаружи клеток. Характер этих изменений зависит от изучаемого образца и обработки криопротекторами, но главным образом, от скорости охлаждения. При медленном охлаждении происходит образование внеклеточного льда, приводящее к обезвоживанию клетки до того, как будет достигнута точка замерзания цитоплазмы. При быстром охлаждении клетки быстрее замораживаются изнутри, медленнее обезвоживаются, что приводит к образованию кристаллов льда внутри клетки. В этом случае клетки повреждаются. Обычно охлаждение проводят в два этапа (рис. 26):

Рис. 26. Замораживание клеток: а) быстрое, б) медленное, поэтапное

1-й этап: от +20 до -28 o C со скоростью 1 градус в минуту (для растительных клеток скорость замораживания 0,5 градуса в минуту до -35 о С), выдерживают при этой температуре 15 минут.
2-ой этап: погружение в жидкий азот (мгновенное охлаждение до – 196 o C).

Замораживание производят в специальных аппаратах. При их отсутствии – на спиртовой бане (0,5 – 1 литр спирта наливают в термос с металлической колбой, погружают в него ампулы на 15 минут и добавляют при помешивании жидкий азот или сухой лед; доводят температуру до -32 o C (температура должна быть не выше -28 и не ниже -32 о С). Далее переносят ампулы в жидкий азот.

При размораживании ампулы пинцетом переносят в водяную баню с температурой +37 – +40 о С, ампула объемом в 1 мл размораживается в течение 0,5 – 1 минуты.

После размораживания клетки отмывают либо в ростовой среде (животные), либо в поддерживающей среде. Растительные клетки также можно отмывать 3 – 10% раствором сахарозы.

Далее клетки проверяют на жизнеспособность с помощью витальных красителей, окрашивающих мертвые клетки. Окончательным критерием служит четкое возобновление роста на стандартных питательных средах, используемых для данной культуры.

Перевиваемые культуры животных клеток после размораживания имеют повышенную чувствительность к вирусам, которая проявляется в течение первых двух пассажей. Далее чувствительность возвращается к исходной.

Замедления роста можно добиться следующими методами:

1. Хранение под слоем минерального масла (для бактериальных и грибных культур).

2. Изменение газового состава и атмосферного давления внутри культурального сосуда.

3. Изменение светового режима.

4. Охлаждение до температуры прекращения активного роста.

5. Применение гормональных и осмотических ингибиторов. Из гормональных ингибиторов наиболее часто используют хлорхолинхлорид (для растительных клеток), из осмотических – маннит в концентрации 3-6%.

6. Замена СaCl₂ на Ca(NO₃)₂ в питательных средах.

Для картофеля в качестве способа, позволяющего сохранить генофонд, рекомендуется клубнеобразование в пробирках.

Биотехнология криосохранения семян и протокормов орхидей

УДК 581.143.6 + 581.165.1
БИОТЕХНОЛОГИЯ КРИОСОХРАНЕНИЯ СЕМЯН И ПРОТОКОРМОВ ОРХИДЕЙ
Г.Л. Коломейцева Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина, г. Москва Т. В. Никишина, Е.В. Попова, А.С. Попов Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва
Массовое размножение декоративных сортов и клонов, а также сохранение редких и исчезающих видов орхидных ex situ требует использования биотехнологических методов, среди которых наиболее значимыми являются семенное и микроклональное размножение in vitro и создание криобанков длительного хранения семян, меристем и протокормов.
Орхидеи – красивые и полезные травянистые растения, которые издавна используются как в декоративном садоводстве, так и в фармакологии, а в последние годы также и в производстве дамских шляпок и туалетов. Вместе с тем, семейство орхидных может служить примером крупного таксона цветковых растений, многие представители которого являются редкими и входят в Красные книги и международные списки охраняемых видов. Поэтому в настоящее время успешно разрабатываются биотехнологические методы их семенного и микроклонального размножения, которые, с одной стороны, способствуют сохранению природных популяций редких видов, а, с другой стороны, позволяют шире внедрить орхидные в коммерческое производство и садоводство в качестве лекарственных и декоративных растений. Тем самым они уже становятся отраслью сельского хозяйства.
Способами сохранения генофонда редких и эндемичных видов орхидных в искусственных условиях ex situ могут быть: – создание коллекций живых растений [1,2]; -создание банков зародышевой плазмы в виде семян, меристем, пыльцы, культур клеток, культур тканей и другого генетического материала [3-8].
Массовое семенное размножение орхидных традиционным способом (посев на земельные субстраты) мало осуществимо из-за облигатного симбиотрофизма начальных стадий их прорастания, поэтому семенное размножение представителей этого семейства осуществляется, в основном, в асимбиотической культуре in vitro на питательных средах. За последние годы к затрудненно прорастающим семенам орхидных. был применен экологический подход, с помощью которого удалось преодолеть фазу биологического покоя у семян многих орхидных умеренной зоны и аридных областей Земли, обусловленную локализованными в семенной кожуре ингибиторами. Для этого использовали посев недозрелых семян, удаление ингибиторов специальными растворами и содержание посевов и проростков в условиях, максимально приближенных к реально существующим в природе (низкие температуры зимой, отсутствие света) [9, 10].
При проращивании семян орхидей в культуре in vitro и последующей пересадке развивающихся сеянцев на новые среды часто происходит непроизвольная селекция. Выбор особей для дальнейшего культивирования определяется по фенотипическим признакам и в зависимости от целей исследователя. Это могут быть одиночные протокормы, максимально быстро переходящие к гемморизогенезу, или конгломераты протокормов с дополнительными меристематическими центрами, способными к многократному почкованию, или аморфные каллусообразные тела, медленно нарастающие в культуре в течение многих лет.
Отбор растений с определенным фенотипом из посева маточников неизбежно приводит к обеднению генотипа в целом, причем, чем дольше сохраняется популяция, отобранная из гетерогенного посева, тем более гомогенной она становится. Особенно часто можно столкнуться с вырождающейся популяцией орхидных in vitro в случае отбора на максимальную продуктивность на стадии протокормообразования. Чем дольше сохраняется в культуре in vitro такая популяция, тем менее жизнеспособными становятся производимые от нее растения-регенеранты.
Таким образом, депонирование редких орхидных ex situ в виде живых коллекций протокормов и каллусных культур неизбежно приводит к вырождению гетерогенных популяций. В качестве альтернативного пути сохранения генофонда орхидных, как редких и исчезающих растений, мы исследовали возможность долговременного сохранения семян и протокормов в криобанке при температуре жидкого азота.
Зрелые семена орхидей самой своей природой прекрасно подготовлены к длительному хранению в жидком азоте. Они имеют слабо дифференцированный зародыш, нередко состоящий всего из нескольких клеток, обладают изначальной низкой влажностью, небольшими размерами (250-1500 мкм в длину, 270-990 мкм в ширину), тонкой сетчатой семенной кожурой и практически полным отсутствием эндосперма [11].
В данной работе мы использовали зрелые семена, которые проращивали на агаризованной безгормональной питательной среде (1/2 MS) в темноте при 25-26 °С. Замораживали семена в полиэтиленовых ампулах, быстро погружая их в жидкий азот. Хранили в крио-банке
7-30 дней. Ампулы оттаивали в воде при 41 °С в течение 30 с. Протокормы замораживали в пластиковых соломках (диаметр 2, длина 132 мм) после обработки нагружающим и витрифицирующим растворами. В качестве последнего применили PVS2PEg –

Таблица 1
Характеристика семян и их всхожесть до и после криосохранения

Источники:

http://naukarus.com/kriosohranenie-semyan-i-protokormov-redkih-orhidey-umerennogo-klimata
http://www.biotechnolog.ru/pcell/pcell8_1.htm
http://vinograd.info/knigi/sovremennye-dostizheniya-biotehnologii/biotehnologiya-kriosohraneniya-semyan-i-protokormov-orhidey.html