Значение отдельных фракций белка в водоудерживающей способности клеток и методы их определения
Значение отдельных фракций белка в водоудерживающей способности клеток и методы их определения
Значение отдельных фракций белка в водоудерживающей способности клеток
Водоудерживающая способность клеток тканей или сила связывания воды зависит от состояния структурных элементов клетки, удерживающих ее.
Есть основания полагать, что изменение состояния воды зависит от структур микромолекул белка и изменения их свойств (А.М. Алексеев, Н.А.Гусев, Г.В. Лебедев, 1963).
Одним из Таких свойств является способность белков растворяться в различных растворителях. При исследовании качественного состава белков растений (листьев) установлено, что фракция водорастворимых белков является наиболее термостабильной (А.В.Благовещенский, 1960; А.В.Благовещенский и EX.Александрова, 1961). И.М.Васильевой (1964) установлена положительная корреляция между повышением морозоустойчивости листьев озимой пшеницы и увеличением Доли водорастворимых белков, относительная величина соле-спирто— и щелочерастворимых белковых фракций яри этом падала. Относительное содержание неэкстрагируемого белка в процессе закаливания не изменялось, но существенные изменения этой фракции наблюдаются в течение вегетационного периода.
Считается (У.Хебер, 1959), что защитное действие водорастворимых белков может проявляться благодаря возникновению водородных связей между гидратной водой, удерживаемой низкомолекулярными белками, в СО в NH — грушами высокомолекулярных белков. Водорастворимые белки влияют и на состояние воды в растениях. Коэффициент корреляции между содержанием водорастворимых белков и фракцией воды, удерживаемой силами свыше 93 атм., близок к 1 (И.М.Васильева в др., 1964).
Для выяснения роли различных белков в изменении водоудерживающей способности тканей виноградной лозы был использован метод Шнейдера, описанный Б.Х. Буракаевой ( 1964), с некоторыми изменениями, связанными со специфической особенностью исследуемого объекта.
Материалом для исследования служат виноградные лозы с расположенными на них глазками. Лозы для этой цели отбирают на нормально развитых рукавах на анализ берут среднюю часть. Инактивацию ферментов лучше всего проводить путем быстрого замораживания, по можно использовать материал, в котором инактивация была проведена термическим путем. Инактивированные и высушенные ткани следует измельчать до состояния пудры, так как иначе извлечение фракций бел. ка будет неполным.
1 г воздушно-сухой навески растирают с небольшим количеством воды (3 мл) до однородной массы и переносят в центрифужную пробирку (растирают со стеклянной пылью). Общий объем воды в пробирке доводят до 25 мл. Залитые водой пробирки оставляют на 12- 14 часов. Затем содержимое пробирки перемешивают стеклянной палочкой и помещают на встряхиватель на 2 часа. Рекомендуемая Буракаевой для листов десяти- минутная экстракция без последующего встряхивания не обеспечивает полноты извлечения водорастворимых белков из тканей коры и древесины. Затем проводят центрифугирование в течение 10 минут при 6000об/мин.
Экстракцию повторяют еще 3 раза, но каждый раз со встряхиванием в течение получаса. Центрифугаты сливают в колбочку. Общее количество экстракта должно составить 100 мл. Затем добавляют охлажденную 30—процентную трихлоруксусную кислоту из расчета конечной концентрации 3% и смесь оставляют на холоде 16-18 часов. Осажденные водорастворимые белки фильтруют через беззольный фильтр, 2-3 раза промывают горячей дистиллированной водой (для удаления трихлоруксусной кислоты). Затем фильтры высушивают, помешают в колбы для сжигания заливают 5 мл HgS04 (уд.вес-1,84). Колбочки нагревают до выделения белых паров, снимают с плитки, охлаждают, добавляют 8-9 капель пергидроля и снова ставят на плитку. Операцию повторяют до полного обесцвечивания жидкости. В сожженном растворе определяют азот водорастворимых белков альбуминов колориметрическим методом (В.В.Гриценко, 1965).
После удаления солерастворимых белков остаток в центрифужных пробирках заливают 25 мл 70-процентного этилового спирта и оставляют на 12-14 часов, после чего все операции повторяют. Эта фракция Служит для определения азота спирторастворимых белков проламинов.
Остаток заливают в центрифужные пробирки 25 мл 0,02 н. N аОН и встряхивают в течение 2 часов, затем все операция повторяют и в центрифугате определяют азот щелочнорастворимых белков глютелинов. Остаток после извлечения всех фракций переносят на беззольный фильтр, высушивают и заливают 13 мл H3SO4 (уд. вес-1,84). После сжигания определяют азот неэкстрагируемых белков.
Примененная методика дала возможность установить наличие корреляции между изменением фракционного состава белков и водоудерживающими силами клеток тканей виноградной лозы при действии отрицательных температур.
При исследовании водоудерживающих сил клетки у виноградной лозы в зимний период было установлено, что падение температуры в январе до -20 С приводит к уменьшению водоудерживающей способности тканей лозы сорта Рислинг. При этом увеличиваются водорастворимая и щелочнорастворимая фракции Белков. Относительные величины фракции неэкстрагируемых белков не изменяются по сравнению с периодом умеренных температур.
При менее значительном понижении температуры в марте у лоз, прошедших вторичное закаливание, происходит увеличение водоудерживающей способности клеток тканей. Это коррелирует с уменьшением водорастворимых белков и увеличением удельного веса в общем количестве белковых соединений неэкстрагируемой фракции. Эта реакция на внезапное понижение температуры типична для всех сортов независимо от их происхождения и биологической природы.
Эта методика может быть применена в работах с апробированными сортами винограда в отношении их устойчивости к повреждающим факторам, так как она характеризует механизм использования растением водоудерживающих сил как защитное средство от обезвоживания.
Значение отдельных фракций белка в водоудерживающей способности клеток и методы их определения
Технические весы, растения,ножницы.
Литература: 6, с.64-65
1 Как происходят поглощение и выделение воды клеткой?
2 Какое биологическое значение имеет транспирация?
3 Какие изменения наблюдаются у растений при адаптации к дефициту воды?
Тема 7 Выявление защитного действия сахаров на протоплазму
Цель: 1 Определить факторы, повышающие водоудерживающую способность растений
План: 1 Влияние замораживания на белки
3 Защитное действие сахарозы на белки
Методические рекомендации по подготовке к занятию
При воздействии отрицательных температур на растительные ткани в межклетниках образуется лед, который, оттягивая воду из клеток, обезвоживает протоплазму. При определенной степени обезвоживания, индивидуальной для каждого организма, протоплазма коагулирует.
Кристаллы льда, образующиеся непосредственно в клетках, оказывают механическое воздействие, в результате нарушается внутренняя структура протоплазмы, резко повышается ее проницаемость, а при длительной экспозиции на морозе наступает отмирание. Скорость отмирания протоплазмы клеток зависит как от температуры времени экспозиции, так и от водоудерживающей способности самой клетки. Увеличение количества растворимых сахаров в зимующих органах растений повышает водоудерживающую способность тканей.
Ход работы. Из поперечного среза столовой свеклы толщиной 0,5 см при помощи пробочного сверла диаметром 5-6 мм делают высечки. Тщательно промывают их под водопроводной водой и помещают в три пробирки по три высечки в каждую пробирку наливают 5 мл дистиллированной воды, во вторую – 0,5 мл 0,5 М раствора сахарозы, в третью – 0,5 мл 1 М раствора сахарозы. Пробирки этикетируют и на 20 мин погружают в охладительную смесь, состоящую из трех частей льда или снега и одной части поваренной соли. Затем пробирки вынимают из охладительной смеси и размораживают в стакане воды комнатной температуры. После оттаивания пробирки встряхивают. Отмечают различия винтенсивности окрашивания жидкости в пробирках и объясняют их.
Из анализируемых высечек готовят тонкие срезы и рассматривают под микроскопом при малом увеличении в капле раствора, в котором они находились. Подсчитывают общее число клеток в поле пения и число обесцвеченных клеток, из которых вышел антоциан. результаты опыта записывают в таблицу.
Оборудование.Корнеплоды свеклы, 0,5 и 1 М растворы сахарозы, поваренная соль, лед колотый или снег. Термометр, нож, пробочные сверла диаметром 6 мм, бритвы, пробирки, микроскопы, предметные и покровные стекла, кисточки, карандаши по стеклу, фильтровальная бумага, лопатка для охладительной смеси, стакан.
Литература: 6, с.96-92
1 Как влияет замораживание на белки?
2 Изменяется ли устойчивость белков к низким температурам при повышении осмотического давления раствора?
Белковые фракции
Состав и количество фракций белков в биологических жидкостях зависит от применяемого метода фракционирования:
- нейтральными солями (высаливание) – способность белков плазмы выпадать в осадок при воздействии на них растворов солей различных концентраций,
- этиловым спиртом при низкой температуре;
2. Электрофоретическое фракционирование — различают несколько типов электрофореза в зависимости от поддерживающей среды. В качестве поддерживающих сред используют бумагу, ацетатцеллюлозную пленку, агаровый, полиакриламидный, крахмальный гели. При проведении электрофореза необходимо учитывать факторы, влияющие на подвижность разделяемых веществ:
- заряд (обычно зависит от pH), размеры и форма молекул веществ;
- электрическое поле : скорость миграции ионов прямо пропорциональна силе тока, обусловленной переносом ионов буфера и образца, напряжению и обратно пропорциональна сопротивлению (зависит от типа и размеров носителя и ионной силы буфера);
- тип буфера : состав, концентрация, pH, ионная сила. Ионная сила равна сумме n составляющих: сnzn 2 / 2, где сn — молярная концентрация n-ого иона, z — заряд этого иона;
- носитель : учитывается его гидрофильность, адсорбция веществ на молекулах носителя, электроосмос, диффузия.
3. Иммунологические методы — основаны на иммунных свойствах белковых фракций: иммуноэлектрофорез, электроиммунодиффузия, радиальная иммунодиффузия, радиоиммунный анализ;
4. Седиментационный анализ — основан на различной зависимости скорости оседания белков от массы и величины их молекулы;
5. Ионообменная, адсорбционная, распределительная, аффинная хроматография , гель-фильтрация .
Наиболее распространенным методом фракционирования является электрофорез , основанный на разной скорости движения белков в электрическом поле, в зависимости от величины заряда и молекулярной массы. Количество выделяемых фракций определяется условиями проведения электрофореза и качеством поддерживающей среды. Так, например, при электрофорезе на бумаге и пленках ацетата целлюлозы выделяют 5 фракций (альбумины, α1–, α2–, β– и γ–глобулины), в то время как в полиакриламидном геле — до 20 и более фракций. При использовании более совершенных методов (радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и других) в составе глобулиновых фракций выявляются многочисленные индивидуальные белки.
За основу классификации белков по фракциям принято разделение белков на бумаге. На протеинограмму оказывают влияние только те белки, концентрация которых достаточно высока.
В клинико-диагностических лабораториях наиболее распространены методы электрофореза на бумаге и на ацетатцеллюлозных пленках. В качестве унифицированного утвержден метод электрофореза на ацетатцеллюлозных пленках.
Определение белковых фракций сыворотки крови экспресс-методом
Принцип
Фосфатные буферы разной молярной силы осаждают соответствующие фракции белка, при этом более концентрированные буферы осаждают более мелкодисперсные фракции белка. По степени мутности судят о концентрации фракций белка.
Метод электрофоретического разделения белков на бумаге и ацетатцеллюлозных пленках
Принцип
Коллоидные частицы белка перемещаются в электрическом поле постоянного тока: в щелочной среде к аноду, в кислой — к катоду. В щелочной среде наиболее быстро перемещаются альбумины, α1-, α2– и β-глобулины.
Более подробное описание метода электрофореза можно прочитать здесь.
Источники:
http://vinograd.info/knigi/metodiki-po-fiziologo-biohimicheskim-issledovaniyam/znachenie-otdelnyh-frakciy-belka-v-vodouderzhivayuschey-sposobnosti-kletok.html
http://studfile.net/preview/5351778/page:5/
http://biokhimija.ru/belkovyj-obmen/belki-fractii.html
