Возможности адвентивного органогенеза из соматических тканей малины

Возможности адвентивного органогенеза из соматических тканей малины

УДК 634.711.3:8.085
ВОЗМОЖНОСТИ АДВЕНТИВНОГО ОРГАНОГЕНЕЗА ИЗ СОМАТИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ МАЛИНЫ
С.Л. Расторгуев Мичуринский государственный аграрный университет, г. Мичуринск
Приведены данные о культивировании соматических тканей (листовых дисков и черешков) малины на искусственных питательных средах. Рассмотрена возможность индукции адвентивного органогенеза в системе in vitro. Изучено влияние на регенерацию адвентивных побегов внешних (гормональный состав среды, режим культивирования) и внутренних (генотип сорта, тип экспланта) факторов. Предложены варианты сред с сочетанием цитокинина и ауксинов, на которых получены адвентивные побеги с частотой до 48,2 %. Изменение основных условий культивирования привело к повышению уровня регенерации до 57 %.
Основными причинами, сдерживающими расширение площадей под малиной, являются: отсутствие сортов с высоким потенциалом адаптации к экстремальным факторам внешней среды, с сочетанием предельно выраженных хозяйственно-ценных признаков, трудоемкость ее возделывания и др. В связи с этим важная роль в повышении продуктивности плантаций малины в условиях все возрастающей нестабильности климата принадлежит селекционному улучшению уже существующих сортов. Однако традиционный селекционный процесс получения новых генотипов у плодовых культур довольно длительный.
В настоящее время для сокращения сроков создания биоразнообразия растений и ценных для селекции исходных форм используют современные технологии in vitro, которые базируются на методах культуры изолированных клеток, тканей и органов. Среди них особое внимание селекционеров привлекают приемы индукции сомаклональных вариантов, клеточной и тканевой селекции на устойчивость к стрессам, клонального микроразмножения ценных генотипов, получения трансгенных растений [1].
При культивировании соматических тканей в системе in vitro получены обнадеживающие результаты и выделены растения-регенеранты, характеризующиеся изменчивостью генеративных признаков и устойчивостью к неблагоприятным биотическим факторам среды [2].
Для широкого практического использования культуры изолированных тканей в селекционных исследованиях необходимы, прежде всего, хорошо разработанные системы регенерации растений. Это связано с тем, что способы индукции адвентивного органогенеза универсальны лишь только в общих закономерностях, а применительно к конкретным видам и даже сортам требуют корректировки. Установлено, что на способность изолированных тканей к регенерации оказывают влияние как внешние (химический и гормональный баланс питательной среды, условия культивирования), так и внутренние (генотип растения, тип и состояние экспланта) факторы [3, 4, 5]. Все это необходимо учитывать при поиске оптимальных условий более полной реализации морфогенетических потенций соматических тканей в системе in vitro.
Среди плодовых растений изолированные ткани малины характеризуются относительно высокой регенерационной способностью. Оптимизация приемов стабильного получения регенерантов позволит шире применять биотехнологические методы создания нового исходного материала для селекции малины.
Исследования посвящены изучению влияния генотипа исходных растений, типа экспланта, его положения на питательной среде, гормонального состава среды и режима культивирования (свет, температура) на уровень адвентивного органогенеза из листовых экс- плантов малины.
Объектами исследования для взятия эксплантов были сорта малины (Rubus idaeus L.) Карнавал и Комета, культивируемые in vitro на питательной среде Андерсона с добавками фитогормонов: 1 мг/л 6-БАП (этап размножения) и 0,5 мг/л ИМК (этап укоренения). В качестве исходных эксплантов в экспериментах по индукции адвентивного органогенеза использовали листовые диски и сегменты листовых черешков.
Для регенерации применяли агаризованную питательную среду по прописи Андерсона, в которую вводили цитокинин 6-БАП и ауксины 2,4-Д, ИУК, НУК. Были испытаны различные сочетания препаратов с цитокининовой и ауксиновой активностью.
Основные условия культивирования листовых эксплантов: t = 25 °С, 16-часовой фотопериод, освещенность 2000-3000 люкс. В экспериментах по стимуляции органогенеза изменяли световой и температурный режимы культивирования эксплантов: t = 25 °С, в темноте в течение трех недель; t = 4 °С, в темноте в течение трех недель.
Известно, что основными стимулами морфогенеза являются изменения соотношения фитогормонов в среде для культивирования, а также сам процесс выращивания растительных тканей вне организма. Стеблевой органогенез вызывали добавлением в индукционную среду более высокой концентрации цитокинина по отношению к ауксину. Были испытаны регенерационные среды с содержанием 6-БАП (1,2,5,10,15 мг/л) и одного из ауксинов 2,4-Д, ИУК, НУК в концентрации 0,1 и 0,5 мг/л.
В результате проведенных экспериментов отобраны варианты сред, на которых наблюдали регенерацию адвентивных побегов. При этом частота формирования побегов различалась по вариантам (от 3,3 до 48,2 %) и зависела от исходного генотипа и присутствующих в среде регуляторов роста. Отмечены варианты сред, которые обеспечивали наиболее высокий уровень стеблевого органогенеза (таблица).

Таблица
Регенерация адвентивных побегов из листовых эксплантов
малины (среда Андерсона, 30 г/л глюкозы, 7 г/л агара)

Введение

Ремонтантные формы малины — уникальные ягодные растения, способные в отличие от обычных растений малины плодоносить на однолетних побегах. Лучшие из современных сортов ремонтантного типа обладают высокой урожайностью, крупноплодностью, экологической адаптивностью, пригодны к низкозатратным технологиям возделывания. Однако многие ремонтантные формы малины обладают низким потенциалом вегетативного размножения по сравнению с летними сортами, что затрудняет их размножение и использование в селекционном процессе [3].

Решить проблему ускоренного размножения ценного селекционного материла стало возможным благодаря применению метода клонального микроразмножения. По сравнению с традиционными способами размножения малины — корневыми отпрысками, корневыми и зелеными черенками, этот способ имеет целый ряд несомненных преимуществ. Главные из них высокий коэффициент размножения и возможность оздоровления посадочного материала от ряда вредоносных микроорганизмов, в том числе и от вирусной инфекции.

За последние десятилетия в нашей стране и за рубежом были проведены многочисленные иссле-дования по совершенствованию метода клонального микроразмножения с целью производства высококачественного посадочного материала малины [5, 14]. Выполненные работы позволили определить оптимальные сроки изолирования эксплантов, оптимизировать состав питательных сред, отработать приемы адаптации полученных растений к нестерильным условиям выращивания. В настоящее время этот метод стал рутинным при тиражировании ценного селекционного материала малины в некоторых селекционных программах [7].

Однако биологические особенности ремон-тантных форм малины, связанные с их сложным межвидовым происхождением, стали причиной низкой эффективности предлагаемых биотехно-логических методов размножения малины на не-которых этапах культивирования in vitro. В связи с этим возникла необходимость оптимизации процесса клонального микроразмножения новых ре-монтантных форм малины.

Статья по теме:   Бако чёрный - виноград

Материалы и методы исследования

Весь селекционный материал ремонтантной малины (220 генотипов), используемый нами в работе, был создан на Кокинском опорном пункте ВСТИСП (Брянская обл.). Исследования проводились в Научно-образовательном центре биотехнологии Брянской ГСХА.

Изолирование эксплантов осуществляли в конце лета — начале осени, либо в осенний период. Заготовленные побеги хранили в бытовом холодильнике, при температуре 4 °С. Сегменты стебля с почкой стерилизовали в 0,1 % растворе сулемы (HgCl2) или 0,1 % мертиолята (C9H9HgNaO,S) в течение 3 минут с последующей пятикратной промывкой в стерильной дистиллированной воде. Культивирование первичных эксплантов и последующее размножение осуществляли в модифицированной среде Мурасиге-Скуга [10] с увеличенной в 3 раза концентрацией хелата железа. На этапе введения в культуру in vitro в качестве источника цитокинина вводили 6-бен- зиламинопурин (6-БАП) 0,5 мг/л, тидиазурон (TDZ) в концентрации 0,05-0,2 мг/л, N-(2 хлор- 4-пиридил)-Ы-фепилмочевина (CPPU) в концентрации 0,2-1 мг/л. При размножения растений изучали влияние цитокининов 6-БАП в концентрациях 0,5-2 мг/л и TDZ в концентрации 0.05, 0.1 и 0.2 мг/л.

На этапе укоренения использовали часть минеральной среды Мурасиге-Скуга. В качестве индукторов ризогенеза в среду вводили ПУК или ИМК.

Результаты и обсуждения

Оптимальным сроком введения в культуру in vitro большинства ягодных растений, в том числе и малины, является период активного роста побегов — конец мая, начало июня. Эффективность начального этапа культивирования в эти сроки выявлена и на ремонтантных формах малины [4]. Однако при введении в культуру генотипов малины in vitro в весенне-летний период возникает ряд трудностей. Во-первых, ограниченное число подходящих почек, которые можно использовать для изолирования от побегов. Так, при введении в культуру 28 новых генотипов в весенне-летний период в среднем на каждый приходилось лишь 13 эксплантов. При таком ограниченном количестве материала есть вероятность потери некоторых генотипов из-за контаминации культуры и/пли не- приживаемости эксплантов. Во-вторых, у ремонтантной малины наблюдается ранняя дифферен- цировка почек по цветочному типу, что снижает эффективность применения стандартных методов культивирования. В-третьих, есть вероятность появления сортосмеси при заготовке побегов возобновления при загущенных посадках гибридов.

В настоящее время изолирование эксплантов ремонтантных генотипов малины проводится нами в осенний период, сразу после их селекционной оценки. Однако большинство почек у малины в это время дифференцированы по цветочному типу и при их культивировании на стандартных средах (0,2-0,5 мг/л 6-БАП) отмечается гибель большей части материала. Рост степени приживаемости эксплантов и регенерации растений при введении в культуру в осенний период удалось достичь, используя в качестве источника цитокинина производные дифенилмочевины — тидиазурон и CPPU, которые в низких концентрация (0.1-0.2 мг/л) оказались более эффективными, чем фитогормоны пуринового ряда.

Введение растений малины в культуру in vitro осенью дает возможность начать размножение нужных форм сразу после проведения селекционной оценки и тем самым сократить период их раз-множения. При этом даже в загущенных посадках сеянцев малины интересующий селекционера генотип легко обнаружить при его плодоношении и использовать для изолирования экспланты от нераспустившихся почек с побегов замещения. Кроме этого, при изолировании крупных почек, сформировавшихся на однолетних побегах, быстрее чем в весенний период, происходит регенерация растений, а плотные ороговевшие чешуи почек надежно защищают ткани от повреждения антисептиками при стерилизации.

Установлено, что производные дифенилмочевины в определенной степени стимулируют развитие цветочных структур в условиях in vitro. Так, в зависимости от фазы дифференцировки почек, нередко отмечается появление одного или нескольких бутонов и, как исключительное явление, их распускание. Однако дальнейшего своего развития эти цветочные образования не получают и со временем усыхают, тогда как регенерировавшие побеги сохраняют активный рост.

Регенерация побегов из пазушных почек про-исходит по периферии их основания из запасных меристем. В среднем образуется около 2 побегов на эксплант. Нами установлено, что при использовании в качестве эксплантов цветочных зачатков возможна адвентивная регенерация из них побегов. Однако в связи с возможным появлением сомаклональных вариантов при таком типе регенерации [2] его необходимо применять лишь в исключительных случаях.

Известно, что регенерационный потенциал на-ходится в прямой зависимости от его генотипа. Так, в ряде исследований продемонстрировано, что среди представителей рода Rubus ежевика отличается большим, чем малина, коэффициентом размножения in vitro, а также частотой регенерации при адвентивном органогенезе [12]. Среди представителей одного вида растений могут вы-делятся сорта как с большей, так и с меньшей регенерационной способностью. Возможно, что признаки, определяющие способность к размно-жению у растений in vitro, коррелируют с такими показателями в полевых условиях. Однако основа-тельных экспериментов, подтверждающих это на ремонтантных формах малины, не проводилось, несмотря на актуальность такой информации при планировании работы по тиражированию сортов с использованием культуры ткани. В наших исследо-ваниях при включении большого количества гено-типов было зафиксировано, что высокорослые, ак-тивно растущие в полевых условиях сорта ремон-тантной малины сохраняют такую же способность и в условиях in vitro. Так, из межвидовых сортов ремонтантной малины большим коэффициентом размножения и способностью к ризогенезу in vitro отличается сорт Бабье лето-2, а у трудно укореняе-мого in vitro сорта Геракл в полевых условиях наряду с низкорослыми побегами образуется слабая по сравнению с другими сортами корневая система. Такую же аналогию можно провести между низко-рослым сортом Пингвин, который отличается от-носительно низким коэффициентом размножения в естественных условиях, и высокорослым, активно растущим сортом Оранжевое чудо.

Среди сортов, выделенных из сотен элитных сеянцев нами не было отмечено генотипа, который бы не поддавался удовлетворительному размножению in vitro на стандартных средах с 6-БАП (1-2 мг/л). Однако выделялись генотипы, обладающие очень низкими коэффициентами размножения (не более 2): 6-Х-Ж, 15-220-2 и 16-67-1.

Из существующих способов увеличения коэф-фициента размножения малины можно выделить следующие:

  1. повышение концентрации применяемого ци- токинина. Как правило, рост содержания 6-БАП в среде приводит к образованию большего количества дополнительных побегов. Для малины максимальная концентрация не должна превышать 3 мг/л. Чрезмерно высокие концентрации цитоки- нинов приводят к образованию побегов с морфо-логическими нарушениями, которые проявляются в виде коротких деформированных побегов, скру-ченных листьев, стекловидных органов с признаками гипероводненности;
  2. последовательное чередование высоких и низких концентраций 6-БАП [8];
  3. использование в качестве источника цито- кинина производных дифенилмочевины [1], которые в более низких концентрациях способны вызывать пролиферацию побегов. Превышение оптимальных концентраций цитокининов ряда дифенилмочевины приводит к появлению морфо-логических нарушений у растений, более суще-ственных, чем 6-БАП.
Статья по теме:   Выращивание винограда в Подмосковье - виноград

Не исключено, что новыми способами индукции образования дополнительных побегов могут быть и другие химические и физические факторы.

Из испытанных питательных сред, приготовлен-ных по прописям Мурасиге-Скуга [10], Андерсона [6] и Ли и де Фоссарда [9], первая оказалась наиболее оптимальной для культивирования малины на этапах введения в культуру, собственно размножения и укоренения (1/2 часть). Среда Мурасиге- Скуга (МС) использовалась в большинстве случаев при размножении малины in vitro. Однако следует учитывать, что эта среда в нашей работе содержит тройную концентрацию хелата железа по сравнению с оригинальной прописью.

Среди физических факторов критическое влияние на культивирование малины in vitro оказывает температура. Высокие значения этого показателя (около 30 °С), отмечаемые в весенне-летний период в отсутствии кондиционирования, могут привести к значительным потерям растительного материала. При воздействии высоких температур происходит интенсивное выделение растительными тканями этилена и углекислоты, которые в изолированной системе in vitro накапливаются в высоких концентрациях. Этилен, являясь гормоном старения и созревания, приводит к быстрой гибели растений, особенно уже закончивших рост. В связи с этим при выращивании растений in vitro целесообразно искусственно поддерживать оптимальную температуру в культивационном помещении или избегать размножения растений в жаркие месяцы. Несомненный интерес представляет информация, связанная с определением оптимальных температур и термопериода для культивирования растений малины на каждом этапе клонального микроразмножения. В большинстве случаев в научных работах рекомендуют культивирование растений малины при температуре 20-22 °С [13].

Традиционно для индукции ризогенеза микро-черенков малины используются ауксины ИУК, ИМК и реже НУК. На средах с ИУК укореняются лишь на 30-40 % микрочеренков, и для них более эффективна ИМК (0,5 мг/л).

Для некоторых плохо укореняемых генотипов ремонтантной малины предложен метод укоренения без инкубации на средах с ауксинами. После обмакивания основания стебля в концентрированный раствор ауксинов (1мг/л) растения переносятся на безгормональную среду, что приводит к высокому уровню индукции ризогенеза — до 100 %.

Перспективное направление в получении по-садочного материала малины — укоренение микро-побегов длиной до 2 см непосредственно в субстрате, минуя стадию укоренения в пробирке. Для индукции ризогенеза нами применяется ИМК в концентрации 1 г/л в течение 1 с.

Успех укоренения определяется качеством ис-ходных микрочеренков. Установлено, что доля укорененных растений у крупных побегов выше, чем у мелких. Поэтому между этапами размножения и укоренения вводится дополнительный этап элонгации (удлинения побегов). На нем проводят уменьшение концентрации цитокинина 6-БАП с 1-2 мг/л до 0,2-0,3 мг/л.

Для ускорения ростовых процессов в лаборатории проведен эксперимент по влиянию вита- минно-минерального комплекса «Компливит» на элитные формы ремонтантной малины. Полученные результаты позволяют заключить, что введение в питательную среду МС витамин- но-минерального комплекса «Компливит» (4 г/л) приводит к росту коэффициента размножения и высоты растений. Такой эффект очень важен на последнем в субкультивировании этапе элонгации для получения более крупных побегов.

Высадка размноженных растений с последующей адаптацией их к нестерильным условиям является заключительным и наиболее ответственным этапом, который определяет значительную часть успеха размножения растений in vitro. В связи с рядом особенностей пробирочных растений (слабым функционированием устьичного аппарата, отсутствием кутикулярного слоя и корневых волосков) может наблюдаться значительные потеря высаженного в субстрат материала [11]. Нами установлено, что на приживаемость растений малины большое влияние оказывают тип субстрата, его pH, влажность и температура воздуха.

В своей работе мы практикуем высадку и/или укоренение пробирочных растений в минипарниках для рассады, состоящих из общего поддона, кассет и полупрозрачной крышки, обеспечивающей высокую влажность среды. Кассеты заполняются готовым торфяным субстратом. Ежедневно проводится опрыскивание растений и полив по мере необходимости.

После одного-двух месяцев адаптации в ми-нипарниках, укорененные растения малины с не-сколькими образовавшимися листочками распи-кировываются в ящики и помещаются в теплицу, покрытую нетканым материалом типа «Лутрасил» для адаптации к естественным условиям. В таком случае отсутствует парниковый эффект, в тоже время растения защищены от воздействия низких температур, что способствует лучшему развитию растений.

Органогенез в культуре соматических тканей

Манипуляции в культуре изолированных тканей растений (с использованием или без культуры каллусных клеток) чаще всего осуществляют в соматических тканях.

Реализация тотипотентности соматических клеток лежит в основе вегетативного размножения растений. Отрезки стеблей, корней и листья растений разных таксономических групп способны к регенерации новых побегов и корней.

При культивировании in vitro эти возможности могут быть значительно увеличены, а у растений, не проявляющих регенерационной способности в природных условиях, индуцированы.

Прямой и непрямой пути органогенеза

Если при культивировании развитие корней, стеблевых или цветочных почек происходит из клеток экспланта без образования каллуса, то такой путь органогенеза называют прямым. Путь формирования морфологических структур, приводящих к образованию корней, стеблевых и цветочных почек в каллусной культуре, называют непрямым органогенезом.

Пример прямого органогенеза in vivo и in vitro — образование стеблевых почек у льна. Так, если у 15-дневных проростков льна удалить верхушку стебля, то через определенный промежуток времени из эпидермальных клеток гипокотиля происходит образование многочисленных стеблевых почек. Позже одна из почек доминирует в развитии и дает полноценный стебель. Если сегмент гипокотиля льна размером примерно 15 мм поместить на агаризованную культуральную среду с фитогормонами, то развитие может получить до 170 проростков, формирующихся как из эпидермальных, так и из субэпидермальных клеток.

Возможные пути преобразования, включая органогенез, при культивировании изолированной ткани представлены на рис. 4.12.

Предрасположенность клеток культивируемой ткани к определенному пути органогенеза в условиях in vitro может зависеть от многих факторов:
— таксономической принадлежности и генотипа исходного растения;
— онтогенетического возраста растения;
— локализации ткани, использованной в качестве экспланта;
— действия физических факторов при культивировании;
— длительности культивирования;
— состава питательной среды.

Рассмотрим примеры, подтверждающие эти положения.

Зависимость от таксономической принадлежности наиболее хорошо прослеживается при сравнении особенностей культивирования изолированных органов и тканей у двудольных и однодольных растений.

У двудольных растений каллусную ткань, способную к органогенезу, можно индуцировать не только из меристематических клеток, но и из вполне дифференцированных тканей листьев, стебля, корня. У однодольных растений для получения каллусной ткани в качестве эксплантов используют только ткани, содержащие меристематические клетки. Например, у злаков каллус можно получить из зародышей, гипокотиля, корневых и стеблевых апексов, сегментов молодых листьев, молодых соцветий. Возможности получения растений-регенерантов у злаков еще более ограничены. Регенерация растений происходит в основном из каллуса, индуцированного из молодых зародышей и молодых соцветий.

Статья по теме:   Анаэробиоз и прекращение брожения - Регулирование процесса брожения

Роль генотипа в проявлении морфогенной способности в культуре тканей хорошо изучена на примере разных сортов, изогенных и мутантных линий табака, моркови, цветной капусты, пшеницы, риса и других растений. Выявлены соответствующие доноры с высоким морфогенным потенциалом в культуре in vitro.

Зависимость особенностей органогенеза от онтогенетического состояния растения выявлена, в частности, при изучении культивирования листовых эксплантов эчеверии (семейство Толстянковых) и табака.

Такие различия в характере органогенеза при культивировании на средах одинакового состава определяются содержанием эндогенных фитогормонов в тканях исходного экспланта. Уровень эндогенных фитогормонов определяет и зависимость между типом органогенеза и локализацией ткани, использованной в качестве исходного экспланта.

Особенности органогенеза изучены в зависимости от таких физических факторов, как температура, содержание кислорода в культуральной системе, продолжительность и качество освещения. Результаты многих экспериментов однозначно продемонстрировали, что с увеличением продолжительности культивирования тканей утрачивается их способность к регенерации стеблевых и цветочных почек. Гораздо дольше сохраняется способность к ризогенезу — образованию корней.

Что касается факторов питательной среды, определяющих особенности регенерации в культуре ткани, то в наибольшей степени на индукцию стеблевых почек и корней влияет фитогормональный баланс.

При наличии в среде разного соотношения этих гормонов наблюдаются следующие особенности:
1. Определенное превышение концентрации кинетина над ауксином в неорганизованно растущей каллусной культуре приводит к образованию стеблевых почек и побегов.
2. Увеличение концентрации ауксина способствует развитию корней.
3. Среднее, близкое к равному, соотношение концентраций этих фитогормонов поддерживает неорганизованный рост каллусной ткани.

Процессы органогенеза на клеточном уровне могут носить продолжительный характер и быть асинхронными. В каллусной культуре образование меристематических зон происходит в основном в базальной ее части, контактирующей с питательной средой. Клетки меристематических зон характеризуются интенсивным синтезом РНК и белка и становятся источником формирующихся зачатков органов. Этот процесс контролируется экзогенными фитогормонами, содержащимися в питательной среде, и эндогенными, синтезируемыми самими клетками.

Возможность индуцирования процессов органогенеза и регенерации растений из стеблевых почек в культуре in vitro используется для массового размножения растений.

Соматический эмбриогенез

При культивировании in vitro и из клеток экспланта, и из клеток каллуса могут развиться соматические зародыши, или эмбриоиды, которые, как и стеблевые почки, при прорастании дают целые растения. В зависимости от пути образования эмбриоидов (из экспланта или каллуса) по аналогии с органогенезом различают прямой и непрямой путь соматического эмбриогенеза.

Морфологические различия между стеблевыми почками и эмбриоидами заключаются в следующем. Эмбриоиды развиваются из соматических клеток как автономные структуры. Для соматических зародышей, как и для зиготических, характерна биполярность (рис. 4.13).

Стеблевые почки, развивающиеся и у интактных растений, и в культуре in vitro, монополярны и не автономны, так как связаны сосудистыми тканями с органом растения или каллусной тканью.

Пример соматического эмбриогенеза in vivo — адвентивная полиэмбриония у цитрусовых. В одном семени может развиваться до сорока зародышей. Обычно один зародыш зиготический. Он формируется от слияния половых клеток и несет признаки материнского и отцовского растения. Остальные зародыши — неполовые, развиваются из клеток нуцеллуса, окружающего зародышевый мешок, и несут признаки только материнского растения. Способность к полиэмбрионии у цитрусовых используют для их клонального размножения. Нуцеллус изолируют и культивируют in vitro в условиях, где происходит индукция образования эмбриоидов из отдельных клеток.

Образование структур, подобных зародышевым, впервые описал Ф. Стюард в 60-е гг. Культивирование клеток корня моркови в жидкой среде с кокосовым молоком приводило к их быстрому делению и образованию клеточных агрегатов. Внутри этих агрегатов происходила дифференцировка элементов ксилемы, после чего формировались корневые зачатки.

При переносе культуры на агаризованную среду наблюдалось образование из этих структур побегов, развивающихся в целое растение.

Источником эмбриогенного каллуса у моркови могут быть разные органы: корень, листья, стебель, зиготические зародыши.

Интересной моделью для изучения соматического эмбриогенеза является лютик — Ranunculus sceleratus. На среде, содержащей кокосовое молоко, в соматических тканях и пыльниках формируется эмбриогенный каллус.

В течение трех недель как внутри каллуса, так и на его поверхности образуются эмбриоиды, по своему строению напоминающие зиготические зародыши. Такие же эмбриоиды могут формироваться и из клеток суспензионной культуры. При пассировании соматических зародышей на свежую среду индуцируется развитие проростков, у которых по всему стеблю из отдельных эпидермальных клеток без дополнительной индукции формируются многочисленные эмбриоиды.

У злаков в условиях культивирования эмбриогенный каллус может быть получен из щитков молодых зародышей, помещенных на поверхность агаризованной среды, содержащей 2,4-Д. Соматический эмбриогенез у злаков на примере культурного ячменя был впервые описан в 1970 г. Норстогом.

Различают критические стадии в развитии и прорастании эмбриоидов, индуцированных в каллусной культуре:
1. Дедифференциация клеток экспланта. Этот период связан с активацией генов, контролирующих деление клеток. В культуральную среду необходимо вводить ауксины (например, для злаков) или ауксины в сочетании с цитокининами (для хвойных), стимулирующие как процесс дедифференциации, так и образования эмбриогенных групп клеток.

2. Развитие эмбриоидов, происходящее в зонах эмбриогенных клеток и контролируемое генами, последовательно экспрессирующимися на разных стадиях эмбриоидогенеза. На данном этапе культивирования концентрация ауксинов в питательной среде или снижается, или полностью исключается.

3. Прорастание эмбриоидов и развитие растений. В этот период требования к среде и условиям культивирования могут быть различными в зависимости от культивируемого объекта. Так, для развития растений из эмбриоидов цитрусовых в культуре нуцеллуса необходим гиббереллин, а у винограда культивирование проводят при пониженной температуре (t = 4 °С). Чтобы индуцировать прорастание соматических эмбриоидов у злаков и цикламена, необходимо использовать безгормональную среду или среду с низким содержанием ауксинов.

Возможность получения соматических зародышей у растений используют для получения искусственных семян или при клональном размножении растений.

Источники:

http://vinograd.info/knigi/sovremennye-dostizheniya-biotehnologii/vozmozhnosti-adventivnogo-organogeneza-iz-somaticheskih-tkaney-maliny.html
http://asprus.ru/blog/osobennosti-klonalnogo-mikrorazmnozheniya-remontantnyx-form-maliny/
http://medbe.ru/materials/problemy-i-metody-biotekhnologii/organogenez-v-kulture-somaticheskikh-tkaney/

Ссылка на основную публикацию

Adblock
detector