Схема использования культуры тканей в селекции растений – виноград

Культура тканей растения

КУЛЬТУРА ТКАНЕЙ РАСТЕНИЯ — способность растительных клеток размножаться на искусственных питательных средах. Основана на выращивании в длительной пересадочной культура тканей растений в виде недифференцированной каллусной массы в стерильных условиях. В природе каллусообразование встречается в основном как реакция на повреждение растения, когда на месте раны образуется нарост, а в культуре ткани все растительные клетки превращаются в каллусные. Каллусы растений легко образуются на эксплантатах из различных органов: отрезков стебля, листа, корня, проростков семян, фрагментов паренхимы ткани клубня, органов цветка, плодов, зародышей и т. д.

При помещении эксплантатов на питательную среду паренхимные клетки дедифференцируются, переходят к делению, образуя однородную недифференцированную биомассу, получившую название каллуса. В асептических условиях каллус отделяют и помещают на поверхность агаризованной питательной среды для дальнейшего роста. В результате получают культуру каллусной ткани, которую можно поддерживать неограниченно долго, периодически разделяя ее на трансплантаты и пересаживая на свежую питательную среду.

Одна из важных особенностей культура тканей растений — сохранение способности к синтезу вторичных веществ, свойственных данному виду, — алкалоидов, гликозидов, эфирных масел, стероидов и др. Эта особенность определяет практическую ценность культура тканей растений в области выращивания биомассы клеток как принципиально нового вида лекарственного сырья. В настоящее время технологии, основанные на культивировании тканей высших растений для получения редких и дорогостоящих веществ, включены в биотехнологические программы, создаваемые в России и во многих странах мира (см. Биотехнология).

Использование технологий, основанных на промышленном выращивании культур тканей продуцентов в качестве лекарственного сырья, имеет ряд преимуществ перед традиционными способами получения сырья. Однако использование такого сырья в фармации экономически выгодно только для продуктов, рыночная стоимость которых достаточно велика на международном рынке.

Культуру тканей растений в настоящее время выращивают главным образом двумя способами: поверхностным — на агаризованных питательных средах или различных гелеобразующих подложках и в жидкой питательной среде. В жидкой питательной среде каллус легко распадается на отдельные агрегаты клеток и дает начало суспензионной культуре. Известны два способа культивирования тканей в жидкой питательной среде: а) накопительное и б) непрерывное.

Важный фактор создания эффективной биотехнологической системы — подбор питательной среды, обеспечивающей потребности культуры ткани продуцента в химических компонентах, необходимых для оптимального биосинтеза целевого продукта. Обязательными компонентами питательных сред служат смеси минеральных солей (макро- и микроэлементов), фитогормоны, выступающие как факторы регуляции процессов клеточного деления и дифференциации, и, поскольку питание культур тканей гетеротрофно, источник углерода вводится в состав среды в виде сахарозы. Получение автотрофных культур тканей — пока задача будущего. При приготовлении питательных сред в качестве подложки используют агар-агар, образующий с водой гель. В последнее время в качестве подложки для культуры тканей растений испытывают и другие гелеобраующие вещества: силикагели, биогели, полиакриламидные гели, пенополиуретан и др.

Культура тканей растения служит источником значительной генетической изменчивости, которую называют сомаклональной. Благодаря этой особенности культуру ткани стали интенсивно использовать в генетико-селекционных исследованиях для улучшения свойств растений. Сомаклональная изменчивость представляет основу для получения клеточных линий и штаммов с высокой биосинтетической способностью. Для увеличения спектра изменчивости используют мутагенез и селекцию на клеточном уровне наиболее продуктивных клеточных линий. Получение мутантных клеточных линий в самом ближайшем будущем будет дополнено методами создания продуктивных штаммов путем гибридизации соматических клеток и генетической инженерии (см. Биотехнология).

В СССР развитие метода культуры тканей лекарственных растений связано с именем Р. Г. Бутенко. С 1967 г. по инициативе И. В. Грушвицкого в создана первая лаборатория культуры тканей лекарственных растений в Ленинградском химико-фармацевтическом институте.

Культура тканей

Уже в начале XX века Хаберландт указал на тотипотентность соматических клеток растений и возможность получать растения с помощью культуры тканей. Однако потребовалось более полувека, прежде чем удалось овладеть методами выращивания in vitro суспензии клеток, гормональной регуляции роста и формирования органов, а также регенерации целого растения. Первые успехи были достигнуты с культурой ткани моркови (рис. 20.1) и гибридов табака.

Благодаря проведенным исследованиям соответствующих методов экстрагирования растительных клеток и тканей удалось вызывать ускоренное деление клеток и получать гомогенную ткань каллуса. Такую ткань далее выращивают на питательной среде, которая, помимо других компонентов, содержит гормоны роста – ауксины, стимулирующие рост корней, и цитокинины, вызывающие рост конуса нарастания; в результате получают целое растение. (Перечень видов, из культуры тканей которых удалось регенерировать целые растения, приведен в работе Вэсила и др.) Работа с однолетними растениями, плодовыми культурами и злаковыми травами оказалась более успешной, чем с многолетниками, бобовыми культурами и лесными породами. Культура меристематических тканей стала уже стандартным методом клонового размножения орхидеи и других садовых растений. Огромное преимущество этого метода заключается и в том, что с его помощью получают материал, не зараженный вирусами, бактериями или грибами, в значительной степени осложнявшими процессы размножения в прежние времена.

Особое значение имеет клоновое размножение с использованием метода культуры тканей для лесных пород, характеризующихся продолжительным развитием поколений. Получать растения древесных видов с помощью культуры тканей растения достаточно трудно, но это удалось в опытах с тополем и сосной.

Культуру зародыша применяют уже довольно давно как метод получения межвидовых и межродовых гибридов, у которых удается осуществить скрещивание, но семена погибают из-за недоразвитости эндосперма.

Культура пыльника и пыльцы. У большинства видов регенерацию целого растения легче осуществить из гаплоидных тканей, чем из диплоидных. Кроме того, в клетках гаплоидных тканей содержится только один набор хромосом и при определенных обстоятельствах могут появиться рецессивные мутации; поэтому в данном случае намного легче вызвать спонтанные или индуцировать новые мутации.

Поскольку частота появления гаплоидных растений в природе весьма низка (см. главу 18), их получают путем культуры пыльников и пыльцы. У значительного числа видов покрытосеменных удалось с помощью культуры пыльника вырастить каллус или эмбриоид, особенно в семействах Solanaceae и Gramineae, однако лишь у небольшого числа видов из каллуса удалось регенерировать целое растение – табак, капуста, томаты, райграс, рис, пшеница, тополь, петуния и др. (перечень примеров с указанием литературы см. в работе Вэсила и др.).

Лишь 0,5-5% пыльцевых зерен проходит андрогенез в максимальных условиях культуры, однако если учесть, что только в одной чашке Петри находится огромное число пыльцевых зерен, успех в получении каллуса может быть удовлетворительным. Андрогенез чаще всего протекает в ходе митотического деления вегетативных клеток микроспор, что и приводит к развитию гаплоидных растений. Поскольку пыльцевое зерно содержит еще и два генеративных ядра, а некоторые виды к тому же представляют собой природные полиплоиды, среди регенерантов наряду с гаплоидами появляются и растения с разными уровнями полиплоидии, развивающиеся в результате слияния ядер или эндомитоза. Это, естественно, создает трудности, так как истинных гаплоидов получить не удается.

Следует подчеркнуть большие успехи с культурой пыльников пшеницы, риса и других растений, достигнутые в Китае. Во-первых, разработана очень благоприятная питательная среда для развития пыльцевых зерен, что позволяет получать каллусы и выращивать целые растения. Во-вторых, определена оптимальная фаза развития для культуры пыльников – середина унинуклеарной стадии с температурой 28-30°С. Особое значение имеет и получение наряду с гаплоидами значительного числа спонтанных диплоидов. Это позволило прийти к выводу, что растения F1, полученные из пыльников, весьма пригодны для работы и с их помощью можно быстро создавать гомозиготные линии.

По личному сообщению д-ра Тсун Вена (1981), методика культуры пыльников пшеницы вкратце сводится к следующему. На питательную среду высевают приблизительно 100 000 пыльников растений пшеницы F1, получая около 5000 (5%) зеленых растений, развивающихся из 5000 различных групп каллусных клеток.

Из этих растений регенерируют:
– около 3000 (60%) растений-гаплоидов (Зx);
– около 500 (10%) растений-гетероплоидов, включая и нуллисомики;
– около 1500 (30%) растений-диплоидов (6x).

Из 1500 диплоидных растений около 150 (10%) гетерозиготно по меньшему числу генных каллусных клеток, а

1350 (90%) полностью гомозиготно.

Диплоидные растения возникают при спонтанном удвоении хромосом. Поскольку они появляются с относительно высокой частотой к общему числу растений из пыльцы, их используют для создания чистых линий; при этом отпадает потребность в обработке гаплоидных растений (Зх) колхицином с целью удвоения числа хромосом.

Пыльца растения F1 в действительности представляет поколение F2, таким образом за один год удается получить большое число гомозиготных линий, которых в противном случае необходимо ожидать в течение шести поколений. Следовательно, данный метод культуры пыльника может оказаться очень полезным при сокращении сроков ведения селекции; если бы удалось решить и технические проблемы, он смог бы найти массовое применение.

Получение гаплоидных растений преследует главную цель – создание гомозиготных диплоидных линий для использования гетерозиса; оно помогает решить и другие задачи, позволяя избегать длительного процесса инбридинга. Метод культуры пыльников дает возможность выводить гомозиготные линии и у автонесовместимых видов, что имеет огромное значение для многолетних растений, особенно для лесных пород. Существуют и иные возможности использования гаплоидов, о чем уже говорилось в главе 18.

Культивирование взятых в отдельности клеток (сахарный тростник и др.) позволило бы обнаружить спонтанные и индуцированные мутации, из которых наибольшее число, как правило, элиминирует в процессе отбора на диплоидном и гаплоидном уровне и которые никогда не удается выделить. Вероятно, этот метод будет способствовать более активному использованию мутаций непосредственно в селекции растений.

Селекция методом культуры клеточных тканей и клеток

Введение культуры клеточных тканей и клеток (метод in vitro) может способствовать созданию лучших сортов, более быстрому использованию ценного материала и уникальных форм. В стериль­ную культуру тканей и клеток в принципе возможен перевод всех частей растений, однако для исследований в области селекции имеет значение культура только таких органов, в которых можно индуци­ровать органогенез. К ним можно отнести верхушки побегов (апи­кальная меристема и дифференцированные ткани побега); цветко­вые почки, завязи, семяпочки; пыльники, пыльца; зародыш; клет­ки; ткань каллуса.

Применение метода охватывает следующие этапы работы: вы­бор подходящего для решения поставленной задачи сорта (геноти­па) и нужной части растения для закладки культуры; закладка сте­рильной культуры; создание условий (питательная смесь, темпера­тура, освещение и др.) для стимуляции желательного процесса раз­вития; регенерация жизнеспособных растений; перевод отобранных для селекции растений в грунтовую культуру для включенияих в дальнейший селекционный процесс.

Задачи, решаемые этим методом в селекции, можно сгруппиро­вать в три взаимно связанные группы: 1) расширение генетической базы селекции растений путем получения нового исходного мате­риала; 2) сохранение и размножение ценных элитных растений и линий; 3) получение и сохранение безвирусного материала расте­ний. Ниже перечислены некоторые конкретные методы, которые можно использовать для решения этих задач.

Расширение генетической базы для селекции растений. Обычные методы селекции, основанные на внутривидовой гибридизации и отборе, как правило, ведут к обеднению генетической изменчивости и сужению генетической базы, что влечет за собой потерю ус­тойчивости создаваемых генотипов и их популяций. Эффективность селекции в будущем можно обеспечить только путем постоянного расширения ее генетической базы, что можно осуществить метода­ми культуры тканей и клеток. Для этого используют методы сома­тической межвидовой гибридизации, оплодотворения и эмбрио-культуры, культуры пыльников, пыльцы и отдельных клеток in vitro и сомаклональной селекции.

Сохранение и размножение in vitro ценных элитных растений и линий применяется с целью получения генетически идентичных клонов. При этом обеспечивается:

• сохранение и размножение отдельных генотипов как исход­ных форм для решения специфических селекционных задач;

• быстрое эффективное размножение новых ценных сортов;

• сохранение и эффективное размножение линий для произ­водства гибридных семян растений;

• экономичное размножение высокопродуктивных генотипов лесных пород, декоративных древесных растений и подвоев плодо­вых культур;

• размножение в стерильных условиях при получении безви­русного материала;

• сохранение сортимента вегетативно размножающихся куль­тур и важнейших перекрестноопыляющихся растений.

Для осуществления этих задач используются методы клонирования на основе меристем верхушек побегов в стерильных услови­ях, а также регенерации жизнеспособных растений из других орга­нов (стеблей, кусочков листа, органов цветка, луковиц и др.).

Получение и сохранение безвирусного материала. Эти методы по­лучили распространение в практике сельского хозяйства для осво­бождения от вирусов вегетативно размножаемых растений. Уста­новлено, что концентрация вирусов в растении снижается по мере приближения к конусу нарастания. Сам конус нарастания часто бывает свободным от вирусной инфекции. Это и было использова­но для оздоровления материала путем изолирования меристемы в стерильных условиях и доведения ее до дифференциации in vitro. Изоляция меристемы размером 0,05-0,1 мм очень сложна. И успех дифференциации растений из нее невелик. Поэтому вместе с ней изолируют первые листовые примордии и тогда говорят о верхушке побега, которая имеет размер 0,1-1 мм. Благодаря этому хотя и ог­раничивается надежность получения безвирусного материала, но зато повышается степень его дифференциации. Кроме того метод становится удобным для практического использования. Культивирование производят на питательных средах Мурасиге и Скуга (см. табл. 10.1), Байса, Уайта и Хеллера.

Кратко рассмотренные в настоящем разделе методы широко рас­пространены в мире и продолжают совершенствоваться. Так,понекоторым данным (Г.П. Бутова, 1995 и др.), к началу 90-х годов в 15 странах Европейского сообщества работало более 250 лаборато­рий культуры in vitro, из которых примерно половина в коммерчес­ких целях. Из 550 возделываемых in vitro видов значительное коли­чество составляли древесные и кустарниковые. При этом розой за­нимались в 45 лабораториях, рододендроном — в 25, березой — в 19, дубом — в 18, тополем — в 12, сосной и елью — в 15.

В США насчитывается 270 промышленных лабораторий, в том числе и по древесным породам. В середине 80-х продукция расте­ний, размноженная методом культуры тканей, составила: 50 млн. штук в США, 53 млн. штук в Голландии, 10 млн. штук в ФРГ, около 28 млн. штук в Италии.

В бывшем СССР и в России получением селекционного матери­ала этими методами успешно занимались ряд научных лаборато­рий Москвы, Санкт-Петербурга, Воронежа, Уфы, Мичуринска и др. Однако в последние годы масштабы исследований сократились, хотя перспективность их остается несомненной.

В целом, культура тканей предоставляет новые возможности для повышения эффективности селекции растений. Кроме того, с ее помощью можно создавать новые ценныесорта.

Методы селекции лесных древесных пород, описанные в настоя­щей главе, начали развиваться относительно недавно. Поэтому они и названы в отличие от отбора и гибридизации, нетрадиционными. Стартовые исследования для части из них были начаты в первой половине XX века, но основные успехи достигнуты во второй поло­вине этого века. В последние годы получила развитие идея сочетания традиционных и нетрадиционных методов для более успешного вы­ведения хозяйственно ценных форм.

Однако, несмотря на прогресс селекции, достигаемый этими ме­тодами, широкому их практическому использованию препятствует ряд проблем. Они заключаются в том, что эти методы довольно до­рогие, требуют специально оборудованных лабораторий, приборов и расходных материалов. Кроме того, как и для новых гибридов и от­дельно отобранных лучших деревьев, существуют трудности массо­вого размножения ценных форм трудно черенкующихся видов. С другой стороны, использование метода культурыклеток и клеточных тканей позволит преодолеть и этот барьер. Например, успешные опыты по клеточной репродукции дуба проведены во Франции. По­этому необходимы более активные усилия по разработке методов вегетативного и клонального микроразмножения трудно черенкую­щихся форм лесных древесных пород.

Одним из способов преодаления проблемы является также создание биклоновых семенных плантаций из диплоидных и тетраплоидных растений с целью получения хозяйственно ценных триплоидных форм. В будущем возможна разработка и других эффективных методов сохранания и размножения ценных генотипов лесных древесных пород, выведенных нетрадиционными методами селекции.

Вопросы для самопроверки

1. Охарактеризуйте виды мутаций, используемые в селекции.

2. Что такое полиплоидия и её возможности в селекции лесных древесных пород?

3. Дайте краткую характеристику метода культуры тканей и его использования в селекции лесных древесных пород.

4. Покажите возможности и направления экспериментального мутагенеза.

5. Опишите физические методы получения мутантов, ионизирующие и неиони­зирующие излучения.

6. Приведите результаты, полученные у лесных древесных пород при использо­вании физических методов мутагенеза.

7. Охарактеризуйте химические методы получения мутантов, приведите класси­фикацию мутагенов и результаты их применения у лесных древесных пород.

8. Опишите экспериментальную полиплоидию лесных древесных пород. Приве­дите характеристики митотического, мейотического и зиготического методов получения полиплоидов.

9. Что такое спонтанные и индуцированные полиплоиды лесных древесных по­род? Приведите примеры.

10. Охарактеризуйте селекцию методом культуры клеток и клеточных тканей in vitro:

этапы, задачи и методы.

11. Приведите некоторые результаты использования методов культуры тканей у лесных древесных пород.

12. Укажите основные проблемы практического использования нетрадиционных методов селекции и пути их преодоления.

Источники:

http://www.9lc.com/kultura-tkaney-rasteniya.html
http://www.spec-kniga.ru/rastenievodstvo/principy-i-metody-selekcii-rastenij/novye-metody-selekcii-kultura-tkanej.html
http://helpiks.org/9-27416.html