Роль светового фактора при культивировании винограда in vitro

СОЗДАНИЕ И ХРАНЕНИЕ КОЛЛЕКЦИИ ВИНОГРАДА IN VITRO

Транскрипт

1 УДК : СОЗДАНИЕ И ХРАНЕНИЕ КОЛЛЕКЦИИ ВИНОГРАДА IN VITRO CREATING AND STORING OF GRAPE COLLECTION IN VITRO Н.П. Дорошенко, Т.В. Жукова ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт имени Я.И. Потапенко, г. Новочеркасск, Россия, е-mail: Аннотация. В статье приведены результаты исследований по депонированию винограда in vitro. Показаны способы подготовки к депонированию для оздоровления растений от вирусной и микоплазменной инфекции. Выявлены факторы, способствующие замедлению ростовых процессов, обеспечивающие продолжительное беспересадочное хранение. Создана и поддерживается коллекция из межвидовых сортов винограда селекции института, аборигенных, классических и подвойных сортов винограда. Ключевые слова: виноград, коллекция in vitro, ввод в культуру, способы замедления ростовых процессов, мелафен, салициловая кислота, цефотаксим. N.P. Doroshenko, T.V. Gukowa All-Russian Research Ya.I. Potapenko Institute for Viticulture and Winemaking, Novocherkassk, Russia, е-mail: Summary. The article presents the results of studies on the deposition of grapes in vitro. The methods of preparation for deposition for sanitation of plants from the virus and mycoplasma infection are shown. The factors were revealed, which facilitate growth processes, and ensure prolonged storage without replanting. We created and support the collection of interspecies grape varieties of institute s selection, aboriginal, classical and rootstock types of grapes. Keywords: grapes, collection in vitro, introduction into the culture, the methods of retarding of growth processes, melafen, salycilic acid, tsefotaksim. В условиях глобального экологического неблагополучия проблема сохранения генофонда растений приобретает особое значение. Традиционных средств сохранения биологического разнообразия растений уже недостаточно. Методы культивирования in vitro позволяют создать биотехнологию поддержания и хранения генофонда при замедленном росте этих объектов. Это актуально и для виноградарства. Насущной необходимостью является обеспечение коллекций материалом, находящимся под угрозой исчезновения. При хранении коллекций in vitro в оптимальных условиях роста растений (t =20 23ºC), возникает необходимость частого переноса

2 микрорастений на свежую питательную среду, что повышает стоимость хранения образца и увеличивает риск его инфицирования различными микроорганизмами. Кроме того, частое пассирование микропобегов стимулирует активное деление клеток, что может способствовать возникновению сомаклональных вариантов. Для увеличения интервала между пассажами используют различные методы и приемы, основанные на замедлении роста пробирочных растений. Цель исследований для создания генетического банка стерильных культур разработать способы среднесрочного хранения in vitro редких и ценных сортов винограда с учетом сортовых особенностей, состояния маточных растений и морфогенетических процессов, происходящих при этом. Исследования проводились в стационарных условиях лаборатории биотехнологии ВНИИВиВ по общепринятым в биотехнологии методикам [Уайт Ф.Р., 1949, Бутенко Р.Г., 1964; Голодрига П.Я. и др., 1986, Дорошенко Н.П., 1992] по трем направлениям: 1) ввод в культуру in vitro новых сортов: апикальные меристемы + хемотерапия; 2) исследование приемов замедления роста для среднесрочного хранения; 3) осуществление контроля над состоянием растений в процессе хранения и проведение перезакладки коллекции. Коллекции in vitro формируются из меристемных клонов, свободных от патогенов, и сохраняются в контролируемых условиях среды. Наиболее вредоносными патогенами как полевых, так и коллекций in vitro являются бактерии, вирусы и микоплазмы. Для оздоровления от вирусной инфекции оптимизирован способ введения в культуру апикальных меристем размером 0,3 0,2 мм (меристема с одной парой листовых зачатков); хемотерапии, проводимой салициловой кислотой, и антибактериальной хемотерапии, основанной на применении антибиотика цефотаксим. Введение в состав питательной среды антибиотика цефотаксим оказало положительное влияние на регенерацию меристем на этапе ввода (рис.1) и последующих этапах пролиферации и ризогенеза, способствуя оздоровлению растений. Выяснено, что салициловая кислота, также дополняет оздоровление апикальных меристем, улучшая качественные характеристики регенерированных растений, у которых уменьшается число растений со скрученными, шиповатыми листьями и число растений с тонкими корнями. Исследована возможность применения в составе питательной среды на этапе ввода в культуру in vitro нового перспективного препарата мелафен, который обладает высокой полифункциональной физиологической активностью в низких концентрациях и рекомендован в качестве регулятора роста растений, отвечающего современным

3 требованиям технологий для испытания на ведущих сельскохозяйственных культурах [1]. А B C Рис. 1. Развитие меристем под действием салициловой кислоты (В) и цефотаксима (С), А контроль. В таблице 1 показано влияние антибиотика цефотаксим и регулятора роста мелафен на регенерацию меристем сорта Саперави северный. Технология создания коллекции генофонда винограда in vitro, основывалась на минимализации роста пробирочных растений при помощи пониженной температуры и освещенности, модификации состава питательной среды, применении повышенных концентраций сахарозы (4 5%), добавления в питательную среду ростовых и осмотических ингибиторов. Перед постановкой на хранение осуществлялось микроразмножение оздоровленных мериклонов, отбор растений и исследование факторов, способствующих замедлению ростовых процессов. Таблица 1 Результаты ввода в культуру меристем сорта Саперави северный, гг. Вариант, цефотак сим, мелафен гибе ль Характеристика состояния меристем, штук мелк. средн. крупн. слабый розетка до 1-3 мм более линейн, листьев 1 мм 3 мм рост Продо лжение ввода, шт. На про лиферац ию, шт. Контроль ЦФ Цф Цф Мф Мф Впервые осуществлено применение природных ингибиторов для депонирования растений винограда. Добавление в питательную среду семян винограда в повышенных концентрациях (1,0 %-ный порошок тонкоразмолотых семян или 20%-ная вытяжка) создает в ней такой уровень естественных ингибиторов, при котором наблюдается снижение ростовых процессов и возможно в 4 5 раз увеличить промежутки времени между пересадками растений на свежую питательную среду [2].

4 Предложены новые условия продолжительного хранения генофонда винограда: до месяцев и более без пересадок за счет использования питательной среды Мурасиге и Скуга, модифицированной для хранения, температуры 4 о С и освещенности 0,3 0,5 тыс. люкс. Выявлена возможность сохранения растений без пересадки в течение дней, используя питательную среду для длительного хранения и понизив освещённость до лк, не изменяя при этом параметры температурного режима [3]. Применение препарата мелафен способствует улучшению морфогенеза растений в культуре in vitro и качественных характеристик растений, регенерированных из меристем, при их микроразмножении [4, 5]. Кроме этого, выявлена возможность хранения растений в культуре in vitro на питательной среде с мелафеном в течение 10 месяцев. Доказана возможность беспересадочного культивирования пробирочных растений винограда в коллекции in vitro в течение 490 дней при введении в состав питательной среды нитрата кальция преимущественно в концентрациях 3,0, 1,5 и 7,5 мм. При повышенных концентрациях сахарозы (70 90 г/л) на начальном этапе культивирования четко проявляется снижение интенсивности ростовых процессов, которое выражается, в первую очередь, в замедлении роста растений. Однако при депонировании в течение 8 10 месяцев в этих вариантах наблюдается более интенсивное высыхание растений и снижение их жизнеспособности. Проведена сравнительная оценка всех изучаемых для депонирования препаратов. Отмечена высокая приживаемость микрочеренков и сохранность растений в течение 110 дней культивирования. При хранении в течение 270 дней также отмечена высокая сохранность растений, особенно, при добавлении в питательную среду препарата мелафен (табл. 2). Таблица 2 Состояние растений через 270 дней хранения в коллекции на питательных средах с различными препаратами, Баклановский, гг. Вариант Сохрани лось Высота, см Число листьев, шт. Коэфф. жизне Оставле но на препарат концентрация шт.% зеленых подсох ших способно сти хранени и, шт. Мелафен / 42,8 16,5 6,6 6,7 1,5 19 Гентамицин 0,05 21/37,5 10,0 6,7 7,2 0,8 15 Цефотаксим /33,9 18,5 6,7 7,6 1,1 15 Са(NО 3) 2 3,5 20/35,7 15,8 7,1 8,6 1,5 16 Салицил. к-та 0,14 19/33,9 16,8 8,3 8,5 1,6 16 Салицил. к-та 1,4 9/16,0 18,0 7,9 10,8 1,4 8

5 Положительным является тот факт, что у растений был определен высокий коэффициент жизнеспособности в вариантах с мелафеном, Са(NО3) 2 и салициловой кислотой в концентрации 0,14 мг/л, что позволило продлить депонирование этих растений. Наблюдение было продолжено (табл. 3). Выявлена хорошая сохранность растений при беспересадочном культивировании в течение 270 и 450 дней, установлена возможность хранения отдельных растений в течение 540 и 630 дней. Лучшая продолжительность беспересадочного хранения отмечена в вариантах с применением в составе питательной среды препаратов мелафен, Са(NО3)2 и цефотаксим. Таким образом, в процессе исследований разработан цикл «введение в культуру in vitro микроразмножение» с учетом сортовых особенностей и состояния маточных растений. Определены факторы, обуславливающие в культуре in vitro замедление ростовых процессов мериклонов. Осуществлена сравнительная оценка различных факторов (свет, температура, состав питательной среды, регуляторы и ингибиторы роста, осмотики, антибиотики и т.д.) и параметров их применения для продолжительного хранения растений винограда в культуре in vitro. Таблица 3 Сохранность растений на питательных средах с различными препаратами, Баклановский, гг. Вариант Сохранилось растений, шт. при продолжительности хранения, дней препарат концентрация, мг/л Мелафен Гентамицин 0, Цефотаксим Са(NО 3) 2 3, Салициловая кислота 0, Салициловая – 1, кислота Создана коллекция из аборигенных сортов винограда: Варюшкин, Кабашный, Косоротовский, Красностоп золотовский, Крестовский, Кукановский, Кумшацкий, Пухляковский, Сибирьковый, Сыпун черный, Цимладар, Цимлянский белый, двух клонов сорта Цимлянский черный и ; сортов селекции института межвидового происхождения: Августа, Баклановский, Золотинка, Илья, Кармакод, Памяти Кострикина, Преображение, Фиолетовый ранний, Саперави северный, классических сортов: Каберне Совиньон, Мерло, Пино нуар,

6 Мускат масандра; подвойных сортов винограда: Гравесак, Кобер 5ББ, SO4, Рупестрис дю Ло, Феркаль и др. Всего в коллекции находятся 42 сорта винограда. Общее число растений Литература 1.Фаттахов, С.Г. Мелафен перспективный регулятор роста растений для сельского хозяйства и биотехнологии / С.Г. Фаттахов, В.С. Резник, А.И. Коновалов // Состояние исследований и перспективы применения регулятора роста нового поколении Мелафен в сельском хозяйстве и биотехнологии: материалы Всероссийского семинара совещания. Казань, С Дорошенко, Н.П. Применение растительной добавки для оптимизации клонального микроразмножения и длительного хранения винограда in vitro / Н..П. Дорошенко, Б.А. Музыченко // Регуляторы роста и развития растений. М., 1997, 290 с. 3. Дорошенко, Н.П. Хранение коллекции винограда in vitro при пониженной температуре / Н.П. Дорошенко, М.А. Козлова, О.Н. Высоцкая и др. // Виноград и вино России С Дорошенко, Н.П. Результаты исследования препарата «Мелафен» в культуре винограда in vitro / Н.П. Дорошенко // Мелафен: механизм действия и области применения / под ред. С.Г. Фаттахова. Казань: Печать Сервис ХХI век, 2014 С Дорошенко, Н.П. Препарат мелафен в культуре винограда in vitro / Н.П. Дорошенко, Т.В. Жукова // Научное наследие Я.И. Потапенко основа современной науки о винограде и вине: материалы международной научно-практической конференции, посвященной 110-летию со дня рождения Я.И. Потапенко. Новочеркасск, С

Влияние интенсивности, спектрального состава освещения и калийного лигногумата на регенерационную способность винограда in vitro

УДК 634.8:577.12
ВЛИЯНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ, СПЕКТРАЛЬНОГО СОСТАВА ОСВЕЩЕНИЯ И КАЛИЙНОГО ЛИГНОГУМАТА НА РЕГЕНЕРАЦИОННУЮ СПОСОБНОСТЬ ВИНОГРАДА IN VITRO
А.А. Соболев, А.Н. Ребров, Н.П. Дорошенко
ГНУ Всероссийский НИИ виноградарства и виноделия им. Я.И. Потапенко,
г. Новочеркасск
Изучено влияние интенсивности и качества освещения при добавлении в питательную среду калийного лигногумата марки AM в процессе культивирования винограда сорта Фиолетовый ранний на этапе микрочеренкования побегов. Установлено, что данные факторы в испытуемых дозах не оказывают влияния на ризогенез, но существенно влияют на надземную часть растений.
Важным фактором регенерации культивируемых тканей является поддержание в них оптимального уровня метаболических процессов. При этом одним из главных источников энергии выступает световая, которая в процессе фотосинтеза превращается в энергию химических связей органических веществ. Благодаря этому преобразованию происходит синтез полимерных соединений, поглощение воды и минеральных веществ, их переработка и транспорт, осуществляются разные виды движения, в том числе и рост. Тем не менее, растительная биомасса способна аккумулировать и эффективно использовать лишь небольшой процент приходящей световой энергии. Кроме того, значительная ее доля расходуется на фотодыхание, а также на теплообмен, флуоресценцию и фотосинтез [1]. Несмотря на то, что радикальных путей снижения затрат ассимилятов пока не найдено, есть данные, что потери сухого вещества биомассы в результате дыхания можно снизить при помощи регуляторов роста [2]. Следует отметить, что расходная часть энергетического баланса существенно зависит от условий культивирования, и в частности, от той же освещенности, содержания в среде гормонов и питательных веществ.
В последнее время все более возрастает интерес к использованию комплексных биоорганических и биоминеральных удобрений, ориентированных на повышение биологического потенциала и продуктивности сельскохозяйственных культур [3]. Одними из таких веществ является гуминовые, полученные в результате утилизации (гумификации) растительного сырья. Помимо прочих преимуществ веществ данной группы перед их синтетическими аналогами, они способны накапливать долгосрочные запасы всех элементов питания (в том числе и углеводов) в различных средах; изменять проницаемость клеточных мембран, повышать активность ферментов, стимулировать процессы дыхания, синтеза белков и углеводов; увеличивать содержание хлорофилла и интенсивность фотосинтеза [4]. Все это делает привлекательным использование препаратов данной группы в биотехнологиях высших растений, особенно учитывая то, что гуминовые кислоты хелатируют ионы кальция и других двувалентных элементов, делают более доступными витамины, аминокислоты и фитогормоны благодаря образованию сложноорганических соединений [5]. Производственные испытания препарата из серии лигногумат при получении меристемных растений более чем 10 видов культур позволили выявить ускорение процессов развития меристем в 1,5-2,0 раза и ризогенеза на 20-30 %; увеличения на 50 % количества корней; повышения уровня укоренения мериклонов в почве до 85-90 %.
Исходя из вышеперечисленного, нами было принято решение: изучить возможность повышения регенерационного потенциала эксплантов винограда при помощи коррекции интенсивности освещения, его спектрального состава и добавления в состав питательной среды лигногумата для более эффективного использования лучевой энергии. Ранее мы уже сообщали о некоторых аспектах культивирования винограда in vitro при освещении светом различного спектрального состава низкой интенсивности [6, 7]. Тем не менее, спектральная избирательность изолированных тканей винограда остается слабо изученной, из чего вытекает необходимость продолжения данных исследований.
Исследования проводили на этапе микрочеренкования побегов сорта Фиолетовый ранний на жидкой питательной среде MS в модификации П.Я. Голодриги, В.А. Зленко и др. [8] с добавлением 0,1 мг/л (3-ИУК при температуре воздуха 24-27 °С и относительной влажности воздуха > 70 %. Испытуемое освещение – экспериментальными фотосинтетическими люминесцентными лампами ЛФ 40-4 (оранжевая область спектра, = 611 нм) и ЛФ 40-5 (преобладание лучей в синей области ФАР, « 450 нм) интенсивностью 2*40 и 3×40 Вт; контроль – люминесцентные лампы дневного света ЛД-40 той же интенсивности.
В качестве источника гуминовых веществ использован калийный лигногумат марки AM в концентрациях 0,005; 0,010 и 0,015 г/л. Общее содержание солей гуминовых веществ в сухом веществе данного препарата составляет более 90 %, из них 60-62 % – органические вещества. Массовая доля высокомолекулярных гуминовых кислот – 70-85 % от органики; 15-30 % – низкомолекулярные, в том числе и фульвокислоты. Содержание металлов, являющихся катионами солей гуминовых веществ: калий – 20 %, кальций – 0,5 %; микроэлементы. Препарат не изменяет рН среды, не выпадает в осадок, термо- и фотостабилен.*

*Изготовитель НПО «Реализация экологических технологий».

На каждый вариант опыта (интенсивность освещения + качество света + концентрация лигногумата) было высажено по 10 эксплантов (одноглазковый микрочеренок с прилежащей листовой пластинкой) в 2-3 повторностях; всего в опыте 520 шт. В качестве контрольных выбраны варианты опыта БС (белый свет, лампы ЛД-40) интенсивностью 2 и 3×40 Вт + 0 г/л лигногумата. Статистическая обработка данных проведена по методикам Т. Литгла, Ф. Хиллза [9], Э.М. Менчера, А.Я. Земшмана [10] с использованием программы Stadia при 95 % уровне доверительной вероятности.
Поскольку наряду с последовательной индукцией определенных генетических программ для регенерации наиболее важна морфологическая ориентация в пространстве, то в качестве основных изучаемых показателей были выбраны характеристики развития ризогенной зоны и надземной части растений-регенерантов. Анализ результатов, полученных после 60 дней культивирования, позволяет говорить о следующем.
Максимальное значимое увеличение ризогенной зоны (количество корней х среднюю длину одного корня) по сравнению с контролем отмечено при 0,015 г/л калийного лигногумата на оранжевом и синем освещении интенсивностью 2×40 Вт (29,5 ± 3,8; 25,8 ± 3,4; контроль – 13,3 ± 0,9 см). Достоверного снижения данного показателя по сравнению с контролем не наблюдалось. Однако проведенный многофакторный дисперсионный анализ показал отсутствие влияния организованных факторов и их взаимодействия как на количество, так и на длину образовавшихся корней.
На изменчивость растений по высоте (таблица) большее влияние оказало качество света, нежели лигногумат. При интенсивности лучевого потока 2Х40 Вт наблюдалось их взаимодействие, которое объясняло 25 % вариабельности результативного признака.
Таблица
Влияние качества, интенсивности освещения и концентрации
лигногумата на высоту растений, см

Роль светового фактора при культивировании винограда in vitro

По всем вопросам, связанным с работой в системе Science Index, обращайтесь, пожалуйста, в службу поддержки:

ПЛОТНОСТЬ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ВИНОГРАДА IN VITRO

В статье рассматривается вопрос разработки и усовершенствования приемов и методов создания и хранения коллекции генофонда винограда in vitro. Исследование посвящено изучению одного из факторов замедляющих ростовые процессы для продолжительного беспересадочного культивирования – увеличение плотности питательной среды. Этот фактор малоизучен и перспективен для рассмотрения. Исследование проводилось на трех сортах (Фиолетовый ранний, Махроватчик, Цимлянский черный), изучались шесть концентрации агар агара (6, 8, 10, 12, 13 и 15 г/л). Показано, что увеличение содержания агар агара в питательной среде сдерживает рост корневой системы и растений винограда. Снижение скорости ростовых процессов отмечено на всех изучаемых сортах, однако интенсивность замедления различна. Исследование подтвердило, что плотность питательной среды является одним из факторов, влияющих на скорость ростовых процессов, требует дальнейшего изучения и может использоваться в технологии создания и хранения коллекции генофонда винограда in vitro.

‘> Входит в РИНЦ ® : да

‘> Цитирований в РИНЦ ® : 0

‘> Входит в ядро РИНЦ ® : нет

‘> Цитирований из ядра РИНЦ ® : 0

‘> Норм. цитируемость по журналу:

‘> Импакт-фактор журнала в РИНЦ: 0,106

‘> Норм. цитируемость по направлению: 0

‘> Дециль в рейтинге по направлению: 8

‘> Тематическое направление: Agriculture, forestry, fisheries

‘> Включено в подборки: 2

‘> Всего отзывов: 0

The article deals with the development and improvement of techniques and methods of creating and storing of a collection of gene pool of vine in vitro. The study is devoted to the study of one of the factors, slowing down the growth processes for longterm uninterrupted cultivation – in-creasing the density of the nutrient medium. This factor is not widespread studied and promising for consideration. The study was conducted on three varieties (Fioletoviy Ranniy, Mohravatchik, Tsimlyansky Cher-niy). Six concentrations of agar agar were studied: 6, 8, 10, 12, 13, 15 gr/l. It is shown that the increase of agar agar in the nutrient medium inhibits the growth of root system and vine plants. A decrease in the rate of growth processes was observed in all studied varieties, but the rate of deceleration is different. The study confirmed that the density of the nutrient medium is one of the factors affecting the rate of growth processes, requires further study and can be used in the technology of creation and storage of the collection of the gene pool of vine in vitro.

Источники:

http://docplayer.ru/28893679-Sozdanie-i-hranenie-kollekcii-vinograda-in-vitro.html
http://vinograd.info/stati/stati/vliyanie-intensivnosti-spektralnogo-sostava-osvescheniya-i-kaliynogo-lignogumata-na-regeneracionnuyu-sposobnost-vinograda-in-vitro.html
http://elibrary.ru/item.asp?id=39543856