Повышение регенерационных способностей эксплантов при клональном микроразмножении винограда

Новые регуляторы роста при клональном микроразмножении винограда

УДК 634.8.037:581.143 6

НОВЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ РОСТА

ПРИ КЛОНАЛЬНОМ МИКРОРАЗМНОЖЕНИИ ВИНОГРАДА

FOR CLONAL MICROPROPAGATION OF GRAPES

им. . г. Новочеркасск, Россия. e-mail: *****@***ru

All-Russian Research Y. I. Potapenko

Institute for viticulture and winemaking

Аннотация. Приведены результаты изучения регуляторов роста нового поколения: Эмистим, салициловая кислота, циркон, эпин-экстра, Мелафен на отдельных этапах клонального микроразмножения. Доказана высокая физиологическая и фунгицидная активность изученных биорегуляторов и полифункциональность их действия, проявляющаяся в стимуляции роста и развития растений, антибактериальной и противовирусной активности в сочетании с антистрессовым действием на растения.

Summary. Paper presents the study of growth regulators of a new generation: Èmistim, salicylic acid, zircon, aepinus-extra, Melafen on different stages of clonal micro propagation. It was proved that the studied bioregulators have high physiological and fungicidal activity and polyfunctionality in the stimulation of plant growth and development, antibacterial and antiviral activity in combination with anti-stress effect on plants.

Ключевые слова: виноград, клональное микроразмножение, Эмистим, салициловая кислота, Циркон, Эпин-экстра, Мелафен.

Keywords: grapes, micro propagation, Èmistim, salicylic acid, Zirconium, Aepinus-extra, Melafen.

Введение. Клональное микроразмножение позволяет получать генетически однородный, оздоровленный посадочный материал, иметь высокий коэффициент размножения, сокращать селекционный процесс, проводить работы в течение круглого года, экономя при этом площади, необходимые для выращивания растений.

Одним из наиболее важных факторов при клональном микроразмножении является содержание в питательной среде регуляторов роста. В мировой практике клонального микроразмножения растений наиболее широко применяется цитокинин 6-бензиламинопурин (БАП) и ауксин – нафтилуксусная кислота (НУК), что связано со стабильностью промышленного производства этих синтетических соединений, устойчивостью их химической структуры при автоклавировании и эффективным индуцированием морфогенеза [1].

Однако для ряда генотипов эффективными в отношении регенерации растений оказываются нетрадиционные индукторы морфогенеза. Природные фитогормоны и синтетические регуляторы роста и развития растений являются мощным химическим средством управления онтогенезом и продукционным процессом растений. Фиторегуляторы – важное средство регулирования дифференцировки клеток, клеточных делений, образования новых тканей и органов, темпов роста и развития растений, их продуктивности и качества урожая. Решающее значение в управлении онтогенезом растений и их продуктивностью имеет изучение и мониторинг фитогормонального статуса.

В задачу нашего исследования входило изучение на отдельных этапах клонального микроразмножения винограда регуляторов роста нового поколения: Эмистим, салициловая кислота, циркон, эпин-экстра, Мелафен. В работе использовали аборигенные сорта, перспективные сорта селекции ВНИИВиВ им. и подвойные сорта винограда.

Исследования проводились в стационарных условиях лаборатории биотехнологии ВНИИВиВ им по общепринятым в биотехнологии методикам [, 1949, , 1964; и др., 1986, , 1992].

Эмистим– универсальный регулятор роста, выделенный из гриба Acremonium lichenicola, имеет широкий спектр действия. Он обладает слабой гибберелловой и цитокининовой активностью, положительно влияет на процессы роста и развития растений, снижает влияние неблагоприятных и стрессовых факторов, активирует защитные механизмы против многих патогенов, является индуктором устойчивости к вирусным заболеваниям [4, 5].

Особое значение имеет применение этого препарата на этапе ввода меристем в культуру in vitro. Меристемы размером 0,1 – 0,2 мм, выделенные и высаженные на питательную среду, нуждаются в защите от стресса и патогенов, в стимуляции клеточного деления для их роста и усиления пролиферации (новообразование узлов и побегов) на следующем этапе собственно микроразмножения.

Добавление в состав питательной среды препарата Эмистим в разведениях 10-8, 10-10 и 1012.способствует улучшению регенерации меристем. Оптимальная концентрация препарата зависит от сортовых особенностей, а также связана с пластичностью поведения сорта в условиях in vitro. Лучшей концентрацией Эмистима по этим показателям для сортов Красностоп золотовский и Сибирьковый является концентрация 10-12%, а для сорта Кумшацкий – 10-8.

Значительное улучшение приживаемости меристем под влиянием эмистима как на первом, так и на втором этапе ввода произошло у сорта Дружба. При концентрации Эмистима 10-9 и 10-11 % приживаемость меристем увеличилась с 56,1 до 71,8–81,2 %. Улучшение репаративной регенерации меристем также отмечено у сортов Платовский и Шардоне, при концентрации 10 –5– 10-6 %.

Улучшение приживаемости меристем можно объяснить тем, что Эмистим защищает их от стресса и патогенов. Увеличение размерных характеристик связано со стимуляцией клеточного деления под действием Эмистима.

Основной показатель результативности следующего этапа: собственно микроразмножения – количество адвентивных побегов, образовавшихся в расчете на одну выделенную меристему (коэффициент размножения). В лучших вариантах с добавлением Эмистима у аборигенных сортов винограда он составил 4,4; 5,4; 7,5 шт. В контрольных вариантах этот показатель равен 2,0; 1,6; 3,2, т. е. меньше в 1,7–4,7 раза.

У сорта Сибирьковый число образовавшихся побегов под влиянием эмистима увеличилось в 1,7 раза, у сорта Красностоп золотовский – в 4,6 раза, у сорта Кабашный – в 1,2–2,1 раза в зависимости от концентрации препарата (табл. 1).

Влияние Эмистима на пролиферацию аборигенных сортов винограда,

Образовалось и срезано побегов (шт.) в вариантах

Таким образом, препарат эмистим оказывает положительное влияние на улучшение регенерационной способности меристем на этапе собственно микроразмножения. Эффективность действия Эмистима зависит от сортовых особенностей винограда и от концентрации этого препарата в составе питательной среды, применяемой на первом этапе ввода того или иного сорта винограда в культуру in vitro.

Помимо положительного влияния эмистима на приживаемость меристем на этапе ввода, повышение регенерационной способности на этапе собственно микроразмножения, отмечено стимулирование роста растений в результате действия этого препарата на этапе микрочеренкования, повышение адаптивной способности растений при переносе их в нестерильные условия.

Рис.1. Влияние различных концентраций Эмистима

на образование побегов у сорта Платовский

При микроразмножении эмистим оказывает двоякое действие на микрочеренки: способствует индукции ризогенеза и, кроме этого, оказывает влияние на конус нарастания почек глазка, способствуя делению клеток и вытягиванию в длину клеток всех тканей. То есть, в данном случае воздействие Эмистима направлено на микрочеренок с целью регенерации из него растения и осуществляется одновременно на тканевом и организменном уровне. В результате его применения происходит оптимизация метаболических процессов, усиливаются функции иммунитета у растений, активизируются защитные механизмы растений против многих патогенов. Гиббереллиновая и цитокининовая активность препарата положительно влияет на процессы роста растений.

Установлены оптимальные концентрации препарата эмистим в составе питательных сред в зависимости от сортовых особенностей. На этапе ввода меристем в культуру следует применять препарат в концентрации 10 8–10-12, для улучшения ризогенеза – 10-10 %, на этапе микрочеренкования – от 10-8 до 10-10.

В публикациях последнего десятилетия салициловая кислота рассматривается как фитогормон растений и один из факторов их защиты от воздействия патогенов микробной и грибной природы [6]. Во время атаки патогенов она резко накапливается в клетках, индуцируя программируемую клеточную смерть вокруг пораженного участка.

В присутствии салициловой кислоты происходит ингибирование распространения вируса ВТМ, одной из причин которого ученые из ИФР им. и кафедры вирусологии МГУ [7] считают снижение проводимости плазмодесм и межклеточного транспорта вируса, что делает желательным применение салициловой кислоты при оздоровлении и клональном микроразмножении в культуре изолированных тканей и органов.

, [8] в процессе хемотерапии выявили антивирусную активность салициловой кислоты в отношении вирусов различной природы у ягодных и плодовых культур. Более того, [9] доказано, что способ оздоровления растений от вирусов с использованием салициловой кислоты позволяет повысить эффективность оздоровления растений от вирусов в среднем на 28–30 % и в 25 раз снизить стоимость процесса оздоровления.

Все вышеизложенное послужило основанием для включения салициловой кислоты в программу исследований с целью улучшения адаптации меристем к условиям культивирования и повышения устойчивости их к вирусной инфекции.

Салициловая кислота, добавленная в состав питательной среды на этапе ввода, способствует улучшению адаптации меристем к условиям культивирования и регенерации из них растений; на этапе микрочеренкования применение СК в диапазоне концентраций 0,14 – 1,0 мг/л улучшает приживаемость микрочеренков, стимулирует корнеобразование, но ингибирует рост растений.

Отмечена различная реакция отдельных сортов винограда на её применение: для подвойных сортов винограда лучшей оказалась концентрация – 1,4 мг/л; для сорта Красностоп золотовский – 0,14 мг/л/.

Салициловая кислота в оптимальных концентрациях отличается низкой фитотоксичностью и даже проявляет стимулирующее действие на процессы органогенеза у растений, повышая коэффициент размножения и ризогенную способность. Учитывая это и антивирусную активность, её следует применять для оздоровления растений в дополнение к культуре меристем.

Продуктивная регенерация меристем при добавлении в состав питательной среды

салициловой кислоты, Красностоп золотовский, 2006 – 2007 гг.

Способ микроклонального размножения винограда “ин витро”

Использование: в сельском хозяйстве и может быть использовано в виноградарстве для ускоренного размещения и оздоровления сортов винограда. Сущность способа: вначале осуществляют микрочеренкование пробирочных растений с 8 10-ю междоузлиями на фрагменты длиной 10 – 12 мм с узлом и листом, а затем высаживают их на твердую питательную среду Мурасиге Скуга. В питательную среду добавляют тонкоразмолотые семена винограда в концентрации 0,1 0,5 от объема среды. 5 табл.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к способам размножения растений, и может быть использовано в виноградарстве для ускоренного размножения и оздоровления перспективных сортов винограда, в исследованиях по физиологии винограда, служит охране окружающей среды.

Известна основная модель клонального микроразмножения растений пролиферация пазушных побегов, основанная на снятии апикального доминирования [1] Есть два направления осуществления этого способа: получение побегов нормальных пропорций с последующим их делением на однопочковые микрочеренки, которые используются в качестве вторичных эксплантов для повторения цикла размножения, введение в питательную среду цитокининов, что приводит к формированию побегов с относительно укороченными междоузлиями, а пазушные почки и меристематические бугорки дают начало новым побегам.

Недостатком данного способа является недостаточно высокий коэффициент размножения в процессе культивирования.

Известен способ клонального микроразмножения винограда микрочеренкованием [2] при котором побег, образовавшийся из изолированной почки и имеющей 8-10 междоузлий, асептически разрезают на фрагменты, включающие узел с листом и почкой. Полученные микрочеренки высаживают в биологические пробирки на агаровую среду, так чтобы нижняя часть была погружена в агар, а затем культивируют в камере фитотрона.

Недостатком способа является то, что в качестве индуктора корнеобразования взята феруловая кислота, которая способна ингибировать рост побегов и снижать выход растений из черенков.

Известен способ микроклонального размножения винограда “Ин витро”, включающий микрочеренкование пробирочных растений с 8-10 междoузлиями на фрагменты длиной 10-12 мм с узлом и листом и высадку их на твердую питательную среду Мурасиге Скуга [3] В качестве индукторов корнеобразования здесь используют индолилмасляную и индолилуксусную кислоты.

Трудность заключается том, что при клональном микроразмножении растения растут относительно медленно и это ограничивает эффективность метода при размножении побегов микрочеренками. Одной из причин медленного роста являются стрессовые условия, в которых находятся растения “Ин витро”. Кроме этого, основной сложностью технологии на первом этапе является ингибирование ростовых процессов экспланта токсическими веществами, выделямыми им в среду. В результате травмы, полученной эксплантом при изолировании, активизируются ферменты, окисляющие фенолы растений, различные фенолозы. Продукты окисления фенолов обычно ингибируют деление и рост клеток экспланта. Чтобы улучшить положение добавляют активированный уголь, который уменьшает число погибающих растений, или антиоксиданты.

Изобретение предназначено для повышения эффективности клонального микроразмножения.

В предложенном способе микроклонального размножения винограда “Ин витро”, заключающем микрочеренкование пробирочных растений с 8-10-ю междоузлиями на фрагменты длиной 10-12 мм с узлом и листом и высадку их на твердую питательную среду Мурасиге Скуга, в питательную среду добавляют тонкоразмолотые семена винограда в концентрации 0,1-0,5% от объема среды.

Новым в предложенном способе является то, что оптимизацию клонального микроразмножения осуществляют за счет питательной среды, в составе которой предлагают стимуляторы роста естественного прохождения, а именно семена винограда, в виде тонкоразмолотого порошка.

Известно, что виноградные семена используют при производстве масла, кормовой муки, удобрений, естественного парника. В предложенном способе семена используются как стимуляторы роста ввиду того, что в них находятся вещества с ценными биологическим свойствами: абсцизовая и хлорогеновая кислоты, общий фенолы, рутин, свободные ауксины и цитокинины.

В состав семян винограда входят такие осмотически активные вещества как соли, сахара, органические кислоты. Также входит большое количество фитогормонов (ауксинов и цитокининов), которые обладают трофическим действием, т.е. способны тормозить деструктивные процессы, которые являются характерной чертой старения органов или целых организмов. Использование семян винограда в виде тонкоразмолотого порошка позволяет адсорбировать токсические вещества, выделяемые растениями при их микрочеренковании в питательную среду, и заменить таким образом активированный уголь. Т.е. налицо неоднозначность предлагаемого приема: адсорбирование токсических веществ, выделяемых пробирочными растениями в питательную среду при их микрочеренковании, и обогащение питательной среды цитокининами, ауксинами и другими фитогормонами, входящими в состав семян винограда. Адсорбирование токсических веществ осуществляют с целью уменьшения ингибирования наружного роста и увеличения регенеративной способности выделенных эксплантов.

Способ осуществляют следующим образом.

Отбирают клонально-размноженные из меристематических верхушек пробирочные растения винограда. Растения должны иметь 8-10 глазков, а затем приступают к приготовлению питательной среды Мурасиге Скуга по общепринятой методике.

Применяют следующий порядок приготовления питательной среды. В 1 л бидистиллированной воды растворяют макроэлементы, микроэлементы, витамины и другие составные части среды.

Навеску предварительно промытого и высушенного агара переносят в колбу, заливают половинным количеством (от объема среды) бидистиллированной воды 1 л и нагревают на плите до 80-100 о С. Семена винограда тщательно промывают, просушивают, перемалывают на лабораторной мельнице до малой фракции около 5 мин. Добавляют их в раствор макро- и микроэлементов, сахара, витаминов и других составных частей среды. Молотые семена добавляют в концентрации 0,25% После растворения и некоторого охлаждения агара к нему добавляют приготовленный раствор. Температура агара и добавленного раствора одинаковая и составляет 80 о С.

Среду фильтруют через два слоя марли и доводят до нужного объема бидистиллятом.

Готовую среду разливают по пробиркам, которые закрывают предварительно простерилизованными в автоклаве ватными пробками, штатив с пробирками закрывают целлофаном и обвязывают шпагатом, а затем среду автоклавируют в автоклаве ГК-1000.

Микрочеренкование осуществляют в операционной комнате в ламинарном боксе “Роботрон”. Побеги, имеющие 8-10 глазков, при помощи пинцета извлекают из пробирки, помещают на стерильную чашку Петри, разрезают на микрочеренки, имеющие узел с листом и почкой. Длина микрочеренка 10-12 мм, 2 мм над почкой, остальные под почкой. Получение микрочеренки высаживают в пробирки с приготовленной твердой средой, так чтобы нижняя часть до почки была погружена в агар. Культивирование осуществляют в культуральной комнате при освещенности 2,0-3,0 тыс.люксов, фотопериоде 16 ч, температуре 25-272 о С, влажности воздуха 70-75% Наблюдения за ростом растений осуществляют через 15 дней. Добавление размолотых семян винограда в первую очередь влияет на развитие корневой системы увеличивается число корней и уменьшается их длина, что объясняется наличием в составе семян свободных ауксинов. В конечном итоге количество корней возрастает в 1,8 раза, соответственно уменьшается их длина, но корни от этого не ухудшаются, они становятся более мощными и общая их масса возрастает в 4,1 раза (табл.1.).

Это оказывает положительное влияние на рост побегов, образование листьев и новых узлов, хотя на первом этапе отличалось угнетение этих процессов, но на втором месяце культивирования скорость роста пробирочных растений увеличивается за счет добавления в питательную среду размолотых семян винограда, что способствует мощному развитию корневой системы. Торможение же роста в течение первого месяца зависит от наличия в составе семян абсцизовой кислоты и фенолов, которые являются ингибиторами широкого спектра действия.

Положительное действие добавки в питательную среду размолотых семян винограда наблюдали при их концентрации 0,1% от объема среды, максимальный положительный эффект был получен при концентрации 0,25% При дальнейшем увеличении концентрации размолотых семян в среде (0,5%) положительное действие сохраняется, но отмечается тенденция к его снижению.

Развитие пробирочных растений в зависимости от количества молотых семян винограда, добавленных в питательную среду (через 63 дня после начала культивирования), представлено в табл.2.

Таким образом, добавление в питательную среду естественных стимуляторов роста из размолотых семян винограда способствует значительному улучшению корневой системы пробирочных растений после их микрочеренкования, что в свою очередь благоприятствует лучшему росту побегов в высоту, развитию большой листовой поверхности, увеличению общей массы побегов. В результате этого увеличивается число узлов (листьев, в пазухе которых находится почка), которые дают начало новым растениям “Ин витро” после их микрочеренкования, т. е. увеличивается потенциальное микрочеренкование и эффективность клонального микроразмножения.

В табл. 3 и 4 соответственно показаны признаки и состав питательной среды.

Предложенная совокупность признаков способствует повышению эффективности клонального микроразмножения на 27,0% и достаточна для достижения поставленной цели.

Добавление в питательную среду размолотых семян винограда оказывает, в первую очередь, положительное влияние на укоренение и развитие корневой системы пробирочных растений: уменьшается длина главного и придаточных корней, но возрастает их число, что способствует увеличению корневой системы.

Динамика развития пробирочных растений без добавления и при добавлении в питательнуюс. реду размолотых семян винограда 0,25 об. среды представлена в табл.5.

СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ВИНОГРАДА “ИН ВИТРО”, включающий микрочеренкование пробирочных растений с 8 10 междоузлиями на фрагменты длиной 10 12 мм с узлом и листом, посадку их на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга и культивирование из них растений, отличающийся тем, что в питательную среду добавляют тонкоразмолотые семена винограда в концентрации 0,1 0,5% от объема среды.

Клональное микроразмножение растений

В природе существует два способа размножения растений: половой (семенной) и вегетативный. Эти способы имеют свои преимущества и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести генетическую пестроту получаемого посадочного материала и длительность ювенильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для большинства видов (в первую очередь для древесных пород) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной.

Это обусловлено следующими причинами:
1) не все породы, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с требуемой эффективностью (дуб, сосна, ель, орехоплодные и др.);

2) практически невозможно с помощью черенкования размножать многие виды древесных пород в возрасте старше 10-15 лет;

3) не всегда удается получать стандартный посадочный материал (существует возможность накопления и передачи инфекции);

4) операции при размножении взрослых (древесных) растений с помощью прививок отличаются трудоемкостью и сложностью;

5) разработанные технологии не эффективны для получения достаточного количества генетически однородного материала в течение года.

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения – клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro (в пробирке) неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, т.е. под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.

Для обозначения растений, полученных бесполым размножением, в 1903 г. Уэббер из Министерства сельского хозяйства США ввел термин клон от греч. clon – черенок (побег), пригодный для размножения.

Клон – популяция клеток, возникших из одной клетки посредством митоза, или группа растений, развившихся вегетативным или бесполым путем, все члены которой произошли из одной повторно культивируемой клетки.
Клональное микроразмножение – получение in vitro неполовым путем растений, генетически идентичных исходному.

Этапы и методы клонального микроразмножения растений

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на четыре этапа: 1 – выбор растения-донора (донор – растение, часть которого вводится в культуру), изолирование эксплантов (эксплант – ткань, взятая из своего оригинального места и перенесенная в искусственную среду для роста и поддержания жизнедеятельности) и получение хорошо растущей стерильной культуры; 2 – собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества мериклонов (микропобегов); 3 – укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (2-10 С); 4 – выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле (рис. 4.1).

Существует много методов клонального микроразмножения. Различные авторы, проводя индивидуальные исследования по влиянию условий культивирования эксплантов на процессы морфогенеза, наблюдали разные ответные морфогенетические реакции на изменение условий выращивания, что, в свою очередь, способствовало созданию новых классификаций методов клонального микроразмножения.

В литературе предложены следующие методы микроразмножения растений: активация развития уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля); индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта; индукция соматического эмбриогенеза; дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.

Первый метод, используемый при клональном микроразмножении растений, – это активация развития уже существующих в растении меристем, основывающийся на снятии апикального доминирования. Это может быть достигнуто двумя путями:

1. Удаление верхушечной меристемы стебля (снятие апикального доминирования) и последующее микрочеренкование побега in vitro на безгормональной среде. Апикальное доминирование – подавление роста боковых почек растительного побега или наличие терминальной почки.

2. Добавление в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как правило, в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин), а также 2-изопентениладенин (2-iр) и зеатин. Полученные таким образом побеги отделяют от первичного материнского экспланта (инокулюм (трансплант) – часть суспензионной или каллусной культуры, переносимой в свежую питательную среду) и вновь самостоятельно культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков (рис. 4.2).

В настоящее время этот метод широко используется в производстве безвирусного посадочного материала сельскохозяйственных культур, таких как технические (сахарная свекла, хмель, табак, топинамбур, стахис) и овощные (томаты, картофель, огурец, перец, тыква, спаржа и др.), а также для размножения культур промышленного цветоводства (гвоздика, хризантема, роза, гербера), тропических и субтропических растений (рододендрон, азалия, камелия, чай и др.), плодовых и ягодных культур (яблоня, слива, вишня, груша, виноград, малина, смородина, крыжовник и др.) и древесных растений (тополь, ива, ольха, береза, рябина, секвойя, туя, можжевельник и др.).

Для некоторых сельскохозяйственных культур, таких как картофель, технология клонального микроразмножения поставлена на промышленную основу (рис. 4.3). Применение метода активации развития существующих в растении меристем позволяет получать из одной меристемы картофеля более 105 растений в год, причем технология предусматривает получение в пробирках микроклубней – ценного безвирусного семенного материала.
Формирование растения капусты из пазушной почки показано на рис 4.4.

Второй метод – это индукция возникновения адвентивных почек непосредственно на тканях экспланта. (Адвентивный – добавочный побег. Развитие растений из необычных точек происхождения, например, почечные или корневые ткани, возникающие из каллуса, или зародыши, развивающиеся из других источников, а не из зигот.

Этот термин также может быть использован для описания агентов, загрязняющих клеточные культуры). Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и таким образом регенерировать целые растения.

Образования адвентивных почек можно добиться почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковицы, сегментов корней и зачатков соцветий), если их удается получить свободными от инфекции. Этот процесс, как правило, происходит на питательных средах, содержащих один цитокинин или в сочетании с ауксином, находящихся в соотношении 10:1 или 100:1. В качестве ауксина в этом случае наиболее часто используют в -индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) или а-нафтилуксусную кислоту (НУК).

Это наиболее распространенный метод микроразмножения высших растений, которым были размножены многие луковичные цветочные растения (нарциссы, лилии, гиацинты, гладиолусы, тюльпаны) из луковичных чешуи, сегментов базальной части донца луковиц, эксплантов листьев; представители рода Бразика (капуста цветная, кочанная, брюссельская, листовая, брокколи) – из сегментов гипокотиля, котиледона, листьев; лук, чеснок – из верхушечной меристемы, ткани донца луковиц; томаты – из апикальных или пазушных меристем; салат цикорный – из сегментов листовых пластинок; петуния – из сегментов корней; глоксиния, сенполия, стрептокарпус, эшинапсус – из сегментов листовых пластинок, а также некоторые представители древесных растений – из изолированных зрелых и незрелых зародышей.

Несомненный интерес вызывает вопрос, связанный с происхождением адвентивных почек, в частности, какие клеточные слои участвуют в дифференциации меристем. Единого мнения по этому вопросу пока нет. Так, Тран Тан Ван в своих работах с тканями табака установила, что именно эпидермис является наиболее активной тканью, способной образовывать почки, каллус или корни в зависимости от гормонального баланса питательной среды.

Цитологические исследования, проведенные на сегментах базальной части донца луковиц тюльпанов и нарциссов, показали, что адвентивные побеги формируются из поверхностных слоев меристематических клеток, прилегающих к донцу, а для растений глоксинии, сенполии и стрептокарпуса процесс формирования адвентивных почек, как правило, происходит в субэпидермальных клеточных слоях листовых пластинок.

Единого мнения по этому вопросу также нет и среди исследователей, работающих с древесными растениями. Так, Арнольд и Эрихсон, Джонсон и Борнмап считают, что образование почек на изолированной хвое ели обыкновенной под действием БАП и 2ip происходит в эпидермальном слое культивируемого экспланта, по мнению Чин и Ченга, для псевдотсуги – в субэпидермальных слоях; а Вилалобос и другие утверждают, что при культивировании семядолей сосны замечательной на среде, содержащей один цитокинин, этот процесс происходит одновременно в эпидермальном и субэпидермальном слоях. Для сосны обыкновенной также было отмечено образование адвентивных почек в эпидермальном и субэпидермальном слоях семядолей зародыша. Этот процесс для сосны не зависит от применяемых цитокининов.

Третий метод, практикуемый при клональном микроразмножении, основывается на дифференциации из соматических клеток зародышеподобных структур, которые по своему внешнему виду напоминают зиготические зародыши. Этот метод получил название соматический эмбриогенез (рис. 4.5).

Основное отличие образования зародышей in vitro и in vivo (в естественных условиях) заключается в том, что соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня. Согласно Стеварду, соматические зародыши проходят три стадии развития: глобулярную, сердцевидную, торпедо-видную и в конечном счете имеют тенденцию к развитию в проросток.

Это явление впервые было отмечено в культуре клеток моркови еще в середине 50-х гг., а в настоящее время используется для размножения большинства растений из семейства Orchidaceae и Rutaceae, а также для некоторых представителей злаковых (пшеница, ячмень), люцерны, редиса, винограда и некоторых видов древесных пород (осина, эвкалипт, дуб, ель обыкновенная).

Формирование эмбриоидов в культуре тканей происходит в два этапа. На первом этапе клетки экспланта дифференцируются за счет добавления в питательную среду ауксинов, как правило, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и превращаются в эмбриональные. Для формирования эмбриоидов необходимо уменьшать концентрацию ауксина или полностью его исключать из состава питательной среды.

Соматический эмбриогенез возможно наблюдать непосредственно в тканях первичного экспланта, а также в каллусной культуре. Причем последний способ менее пригоден при клональном микроразмножении, так как посадочный материал, полученный таким методом, будет генетически нестабилен по отношению к растению-донору. Как правило, соматический эмбриогенез происходит при культивировании каллусных клеток в жидкой питательной среде (суспензии) и является наиболее трудоемкой операцией.

Однако этот метод размножения имеет свои преимущества, связанные с сокращением последнего (третьего) этапа клонального микроразмножения, не требующего подбора специальных условий укоренения и адаптации пробирочных растений, потому что соматические зародыши представляют собой полностью сформированные растеньица. При использовании соответствующей техники их капсулирования из этих эмбриоидов возможно получать искусственные семена.

Четвертый метод клонального микроразмножения – дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани. Каллус – неорганизованная, пролиферирующая масса дифференцированных растительных клеток. Дедифференциация – переход специализированных, неделящихся клеток к пролиферации. Практически он мало используется в целях получения посадочного материала in vitro.

Это связано с тем, что при периодическом пересаживании каллусной ткани на свежую питательную среду часто наблюдаются явления, нежелательные при микроразмножении: изменение плоидности культивируемых клеток, структурные перестройки хромосом и накопление генных мутаций, потеря морфогенетического потенциала культивируемыми клетками.

Наряду с генетическими изменениями наблюдаются изменения растений и по морфологии: низкорослость, неправильное жилкование листьев и их расположение по стеблю, образование укороченных, утолщенных междоузлий, уродливость, пониженная устойчивость к болезням и вредителям. Причем длительное культивирование каллусных клеток усугубляет эти изменения, поэтому период неорганизованного роста при микроразмножении должен быть сведен к минимуму.

Однако несмотря на некоторые недостатки, данный метод имеет свои положительные стороны и преимущества.

Во-первых, он является эффективным и экономически выгодным, так как в процессе размножения из каждой индивидуальной каллусной клетки при определенных благоприятных условиях культивирования может сформироваться адвентивная почка, дающая начало новому растению. Во-вторых, в ряде случаев он является единственно возможным способом размножения растений в культуре тканей. В-третьих, представляет большой интерес для селекционеров, так как растения, полученные данным методом, отличаются генетически и морфологически друг от друга. Это дает возможность селекционерам проводить отбор растений по хозяйственно важным признакам и оценивать их поведение в полевых условиях.

Этот метод целесообразно применять лишь к тем растениям, для которых показана генетическая стабильность каллусной ткани, а вариабельность между растениями-регенерантами не превышает уровня естественной изменчивости.

К таким растениям можно отнести амариллис, эписции, драцены, томаты, спаржу, некоторые древесные породы и другие культуры. Через каллусную культуру были размножены: сахарная свекла, некоторые представители рода Бразика, кукуруза, рис, пшеница и другие злаковые, подсолнечник, лен. Разработаны условия, способствующие регенерации растений из каллуса огурца, картофеля, томатов.

В целом методы клонального микроразмножения, несомненно, имеют ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:
– получение генетически однородного посадочного материала;
– освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;
– высокий коэффициент размножения (10 5-10 6 – для травянистых, цветочных растений, 10 4-10 5 – для кустарниковых и древесных, 104 – для хвойных);
– сокращение продолжительности селекционного процесса;
– ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;
– размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;
– возможность проведения работ в течение круглого года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала;
– возможность автоматизации процесса выращивания.

Источники:

http://pandia.ru/text/80/343/6901.php
http://findpatent.ru/patent/204/2041609.html
http://medbe.ru/materials/problemy-i-metody-biotekhnologii/klonalnoe-mikrorazmnozhenie-rasteniy/