Пероксидаза, каталаза, анаэробные дегидрогеназы – Ферменты

Оксидоредуктазы

КЛАССИФИКАЦИЯ И НОМЕНКЛАТУРА ФЕРМЕНТОВ

Современная классификация ферментов разработана Международным биохимическим союзом (1961г.). В ее основу положен тип катализируемой реакции и механизм. Все ферменты делят на шесть классов: I. Оксидоредуктазы. II. Трансферазы. III. Гидролазы. IV. Лиазы. V. Изомеразы. VI. Лигазы.

Каждый фермент имеет кодовый номер по классификации ферментов: первая цифра характеризует класс реакции, вторая − подкласс, третья − подподкласс, четвертая цифра указывает порядковый номер фермента в его подподклассе. Название фермента состоит из двух частей: в первой части − название субстрата (или субстратов), во второй − тип катализируемой реакции.

Оксидоредуктазы

Оксидоредуктазы катализируют окислительно-восстановительные реакции и подразделяются на 5 основных подклассов:

Оксидазы. Катализируют удаление водорода из субстрата, используя при этом в качестве акцептора водорода только кислород. Оксидазы содержат медь, продуктом реакции является вода (исключение составляют реакции, катализируемые уриказой и моноаминоксидазой, в результате которых образуется Н₂О₂).

Общая схема процесса следующая:

В качестве субстратов оксидаз могут выступать фенолы, полифенолы, амины. Примерами ферментов класса оксидаз являются фенолаза, цитохром-оксидаза, моноаминоксидаза, уриказа.

Фенолаза (катехолоксидаза, тирозиназа) − медьсодержащий фермент с широкой специфичностью. Он катализирует превращение монофенола
(в присутствии о-дифенола) в орто-хинон. Медь содержится также в уриказе, катализирующей окисление мочевой кислоты в аллантоин, и в моноаминоксидазе, окисляющей адреналин и тирамин в митохондриях.

Цитохромоксидаза − гемопротеин, который служит конечным компонентом дыхательной цепи и осуществляет перенос электронов на конечный акцептор − кислород. Данный фермент ингибируется оксидом углерода (II), цианидами и сероводородом. Фермент содержит две молекулы гема, в каждой из которых атом железа может переходить из состояния Fe 2+ в состояние Fe 3+ и обратно в ходе окисления и восстановления, а также два атома Сu, каждый из которых взаимодействует с одним из гемов.

Аэробные дегидрогеназы. Катализируют удаление водорода из суб-страта, используя в качестве акцептора водорода не только кислород, но и искусственные акцепторы (например, метиленовый синий). Эти дегидрогеназы относятся к флавопротеинам.

В результате реакции образуется пероксид водорода, а не вода:

В качестве кофермента дегидрогеназы содержат ФАД (флавинаденин-динуклеотид) или ФМН (флавинмононуклеотид). Многие флавопротеиновые ферменты содержат несколько ионов металлов.

К ферментам группы аэробных дегидрогеназ относятся: дегидрогеназа L-аминокислот (оксидаза L-аминокислот), катализирующая окислительное дезаминирование природных L-аминокислот, и ксантиндегидрогеназа (ксантиноксидаза), катализирующая окисление ксантина в мочевую кислоту. Молибденсодержащий фермент ксантиноксидаза играет важную роль в катаболизме пуриновых оснований.

Анаэробные дегидрогеназы. Катализируют удаление водорода из субстрата, но не способны использовать кислород в качестве акцептора.

Общая схема процесса следующая:

Анаэробные дегидрогеназы подразделяются в зависимости от природы кофермента на несколько групп.

НАД + -зависимые (пиридинзависимые, первичные) дегидрогеназы, содержащие в качестве кофермента НАД + или НАДФ + . В общем случае НАД + -зависимые дегидрогеназы катализируют окислительно-восстановительные реакции специфических (например, гликолиза) и общих путей катаболизма (например, цикла Кребса, дыхательной цепи).

Общая схема процесса следующая:

Примером НАД + -зависимых дегидрогеназ могут служить лактатдегидрогеназа, алкогольдегидрогеназа, глутаматдегидрогеназа и др. Например, 1.1.1.27 L-лактат: НАД + -оксидоредуктаза (лактатдегидрогеназа) катализирует взаимопревращение лактата и пирувата:

Пируват L – Лактат

ФАД- и ФМН- зависимые анаэробные дегидрогеназы (флавин-зависимые дегидрогеназы). Первичные флавинзависимые дегидрогеназы переносят восстановительные эквиваленты от субстрата непосредственно на дыхательную цепь. К ним относятся, например, 1.3.99.1 сукцинатдегидрогеназа (СДГ), ацил-КоА-дегидрогеназа и митохондриальная глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа:

Вторичная ФМН-зависимая НАДН-дегидрогеназа − компонент дыхательной цепи, переносящий электроны от НАДН к более электроположительным компонентам:

Еще одна функция флавинзависимых дегидрогеназ − катализируемое дигидролипоилдегидрогеназой дегидрирование восстановленного липоата
(промежуточного продукта при окислительном декарбоксилировании пирувата и a-кетоглутарата). При этом вследствие низкого значения окислительно-восстановительного потенциала системы липоата переносчиком водорода от восстановленного липоата к НАД + является флавопротеин (ФАД).

Цитохромы за исключением цитохромоксидазы классифицируются как анаэробные дегидрогеназы. В дыхательной цепи они служат переносчиками электронов от флавопротеинов к цитохромоксидазе. Цитохромы являются гемопротеинами, у которых атом железа переходит из состояния Fe 2+ в Fe 3+ и обратно в процессе окисления и восстановления. Помимо дыхательной цепи цитохромы имеются в эндоплазматическом ретикулуме (цитохромы Р-450 и b-5).

Гидропероксидазы. К их числу относятся ферменты пероксидаза и каталаза.

Пероксидаза − фермент, катализирующий окисление пероксидом водорода различных органических соединений − фенолов, аминов, аскорбиновой кислоты, цитохрома С. Пероксидаза обнаружена в растениях, молоке, лейкоцитах, тромбоцитах, а также в тканях, в которых происходит метаболизм эйкозаноидов. Фермент содержит протогем, который в отличие от гемовых групп большинства гемопротеинов слабо связан с апоферментом.

Реакция, катализируемая пероксидазой, имеет сложный характер; суммарная реакция выглядит следующим образом:

В эритроцитах глутатионпероксидаза, содержащая в качестве простетической группы селен, катализирует разложение Н₂О₂ и гидропероксидов липидов восстановленным глутатионом и, таким образом, защищает липиды мембран и гемоглобин от окисления пероксидами.

Каталаза − это гемопротеин, содержащий 4 гемовые группы. Наряду с пероксидазной активностью каталаза способна использовать одну молекулу Н₂О₂ в качестве донора электронов, а другую − в качестве акцептора электронов. В организме каталаза в основном разлагает пероксид водорода, образующийся при действии аэробных дегидрогеназ:

Каталаза содержится в крови, костном мозге, мембранах слизистых оболочек, почках и печени.

Во многих тканях, включая и печень, обнаружены микротельца − пероксисомы, которые богаты аэробными дегидрогеназами и каталазой. Биологически выгодно группировать в одном месте как ферменты, приводящие к образованию Н₂О₂, так и ферменты, разлагающие это соединение.

К ферментам, катализирующим образование Н₂О₂, кроме пероксисомных ферментов, относятся также митохондриальные и микросомные системы транспорта электронов.

Оксигеназы.

Ферменты этой группы катализируют включение кисло-рода в молекулу субстрата, которое происходит в две стадии:

1) кислород связывается с активным центром фермента;

2) происходит реакция, в результате которой, связанный кислород восстанавливается или переносится на субстрат.

Оксигеназы не относятся к ферментам, которые катализируют реакции, снабжающие клетку энергией; они участвуют в синтезе и деградации многих типов метаболитов, токсинов и ксенобиотиков. Оксигеназы подразделяются на 2 подгруппы.

Монооксигеназы (гидроксилазы). Эти ферменты катализируют включение в субстрат только одного из атомов молекулы кислорода. Другой атом кислорода восстанавливается до воды; для чего необходим дополнительный донор электронов (косубстрат):

Природа косубстрата может быть различной. Многие оксигеназы используют НАДФН₂. В этом случае суммарное уравнение реакции можно записать как

К подобным системам относятся микросомные цитохром-Р-450-содержащие монооксигеназные системы, участвующие в метаболизме многих лекарственных веществ путем их гидроксилирования. Они находятся в микросомах печени вместе с цитохромом Р-450 и цитохромом b-5. Восстановителями этих цитохромов являются НАДН и НАДФН. Цитохромы окисляются субстратами в результате серии ферментативных реакций, составляющих так называемый гидроксилазный цикл:

Лек – лекарственное вещество

К лекарственным веществам, метаболизм которых идет при участии рассматриваемых систем, относятся, например, морфин и бензпирен. Многие лекарственные вещества (например, фенобарбитал) способны индуцировать синтез микросомных ферментов и цитохрома Р-450. Цитохром Р-450 является одновременно гемо- и флавопротеином, причем флавиновые нуклеотиды выступают в качестве второго донора электронов. Цитохром Р-450 в печени осуществляет гидроксилирование липофильных соединений, образующихся в качестве побочных продуктов или попадающих в организм извне (такие вещества объединяют под общим названием «ксенобиотики»). Введение в их молекулы гидроксильных групп повышает гидрофильность этих веществ, понижает токсичность и облегчает их вывод из организма.

Другой пример подобных систем − митохондриальные цитохром-Р-450-содержащие монооксигеназные системы. Они находятся в коре надпочечников, семенниках, яичниках, плаценте, почках и участвуют в биосинтезе стероидных гормонов из холестерина, катализируют гидроксилирование гидроксихолекальциферола, что приводит к образованию активной формы витамина D₃ (1,25-дигидроксихолекальциферола). В коре надпочечников содержание митохондриального цитохрома Р-450 в 6 раз выше, чем содержание цитохромов в дыхательной цепи.

Диоксигеназы (истинные оксигеназы). Эти ферменты катализируют включение в молекулу субстрата обоих атомов молекулы кислорода:

Примером служат железосодержащие ферменты 1.13.11.5 гомогентизатдиоксигеназа и 1.13.11.6 3-гидроксиантранилатдиоксигеназа, а также некоторые гемсодержащие ферменты, в частности триптофандиоксигеназа (триптофанпирролаза).

77.243.189.108 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно

Исследования каталазы и пероксидазы

Оба эти фермента распространены в живой природе очень широко: каталаза обнаружена практически во всех живых орга­низмах — как животных, так и растительных, а пероксидаза встречается почти во всех растительных клетках. По всей вероят­ности, эти два фермента принадлежат к числу самых важных ферментов. Они очень сходны между собой, так как роль просте – тической группы в обоих случаях играет гем. В настоящем разделе мы будем рассматривать их совместно, хотя по сути дела они относятся к двум разным группам: каталаза катализирует реак – цшо расщепления (она расщепляет перекись водорода на воду и кислород), а пероксидаза — реакцию переноса группы (в при­сутствии подходящего акцептора она катализирует перенос кислорода на этот акцептор, который таким образом окисляется). Функция каталазы состоит в защите живого организма от слишком высоких концентраций перекиси водорода, являющейся продук­том действия различных оксидаз. Этот фермент сравнительно легко можно выделить из таких источников, как печень быка, и получать в кристаллической форме. Каталаза обладает высокой специфичностью по отношению к перекиси водорода: она не ката­лизирует разложения никаких других перекисей, а при реакции с перекисью водорода активность ее исключительно высока. Так,

Фиг. 85. Структура гема.

Расположенный в центре атом железа окружен четырьмя атомами азота. По пятой и шестой координационным связям атома железа могут присоединяться различные груп­пы (гл. 6).

При 0° С одна молекула каталазы может разложить за 1 мин 5 млн. молекул перекиси водорода. Это одна из самых высоких скоростей оборота, известных в настоящее время.

Активность каталазы определяется ее простетической группой, имеющей плоскую структуру (фиг. 85). Эта группа — гем — содер­жит центральный атом железа, окруженный четырьмя атомами азота. Следует, таким образом, ожидать, что ферментативная активность каталазы будет связана с изменениями валентности этого центрального атома железа и что в спектрах ЭПР этого фермента будут наблюдаться как свободнорадикальные сигналы, так, возможно, и сигналы от атомов железа в различных валентных состояниях. Структура пероксидазы в этом отношении очень похожа на структуру каталазы, так как ее простетической группой также является гем, и, судя по данным химических исследований, превращения фермент-субстратного комплекса, образующегося в процессе пероксидазной реакции, должны сопровождаться изме­нениями валентности атома железа.

Поскольку оба фермента могут быть получены в высокоочи – яценной кристаллической форме, их исследовали самыми различ – яыми методами. Но оказалось, что стандартные химические методы не дают возможности полностью выяснить механизм действия этих ферментов. В результате систематических исследований Джордж [26] предложил схему, согласно которой в процессе катализа образуются два промежуточных соединения:

Пероксидаза 4-Н202 С динстше 1 + А 12- Соединение II–J–AH2– ■»■ Соединение I

Соединение II-г П” -> Пероксидаза-4- АН”

Этот механизм предполагает существование двух одноэлект ■ ройных стадий восстановления, при которых образуются свободно радикальные промежуточные продукты АН”. Обычными химиче­скими методами трудно получить однозначные доказательства существования таких промежуточных продуктов, и это как раз тот случай, когда именно метод ЭПР может дать окончательный ответ на этот вопрос.

Исследование пероксидазных систем, выполненное Ямадзаки, Пьеттом и Мэзоном [27, 28], явилось одним из первых успешные систематических исследований ферментативной активности мето­дом ЭПР. Основная цель этой работы заключалась в обнаружении промежуточного продукта АН” и в определении условий, при которых возникает сигнал ЭПР этого свободного радикала. В пер­вых экспериментах авторы использовали метод быстрого замора­живания, подвергая смесь реагирующих растворов глубокому замораживанию через определенные промежутки времени после начала реакции. Результаты этих экспериментов были в основном негативными; в то время считали, что это объясняется низкой концентрацией присутствующих в образце свободных радикалов, но на самом деле это, по-видимому, обусловливалось уширением линии поглощения на твердых образцах в результате диполь – дипольного взаимодействия. В дальнейшем исследования прово­дили зь уже при комнатной температуре, и именно в этих исследо­ваниях впервые были продемонстрированы широкие возможности методов непрерывного и остановленного потока для исследования таких ферментных систем. Применив метод непрерывного потоку (разд. 3.4.2), Ямадзаки, Пьетт и Мэзон [27. 28] записали полный спектр ЭПР, наблюдаемый по прошествии различных промежутков времени после момента смешивания исходных реагентов. Некото­рые спектры, полученные таким способом, приведены на фиг. 86 (концентрация фермента l0

7 71/, ‘^концентрация субстрата 2-Ю-2—5-Ю-3 М, что давало равновесную концентрацию свобод­ных радикалов около 10

6 М). Одно из преимуществ этих исследо­ваний состояло в том, что изучаемый фермент был доступен в довольно больших количествах, вполне достаточных для прове­дения опытов.

А и Б — реакция окисления гидрохинона. В отсутствие фермента (А) сигнала нет, в присутствии фермента (Б) появляется хорошо разрешенная сверхтонкая структура из пяти линий, обусловленная радикалами бензосеми­хинона. В — реакция окисления аскорбиновой кислоты. В этом случае свободные радикалы дают спектр

С дублетной сверхтонкой структурой.

В экспериментах использовались самые различные субстраты; на фиг. 86 представлены результаты, полученные для гидрохинона и перекиси водорода [А и Б) и для аскорбиновой кислоты и пере­киси водорода (В). Можно видеть, что в обоих случаях заметный свободнорадикальный сигнал появляется лишь в том случае, когда в пробу добавляется пероксидаза; этот сигнал очень интенсивен и обнаруживает сверхтонкую структуру,^которую легко иденти­фицировать. Так, состоящих^ из пяти линий спектр, приведенный на фиг. 861 Б, легко идентифицировать как спектр свободного радикала бензосемихинона (см. разд. 1.5; фиг. 13), а спектр из двух сверхтонких линий на фиг. 86, В —Каквспектр, который должен давать радикал аскорбиновой кислоты; при тех значениях рБ которые использовались в эксперименте, оба радикала нахо­дились в анионной форме.

Таким образом, эти исследования методом непрерыгного потока убедительно показали, что катализируемая пероксидазой реакция действительно сопровождается образованием промежуточных сво – боднорадикальных продуктов. В дальнейшем были проведены систематические исследования. кинетики пероксидазной реакции, для чего изменялась продолжительность временного интервала между начальным моментом смешивания растворов и измерением ЭПР поглощения в резонаторе. Таким способом удалось показать, что равновесная концентрация свободных радикалов пропорцио­нальна Вкорню квадратному из общей концентрации фермента. Это подтверждало механизм, ранее предложенный Джорджем [26], и в особенности то, что ни соединение I, ни соединение О не восста­навливаются самими свободнорадикальными промежуточными продуктами, а исчезновение свободных радикалов происходит в результате процессов дисмутации или димеризации. Позднее Пьетт и сотр. [29], изучив реакцию окисления хлорпромазина в системе пероксидаза — водород — перекись водорода с помощью оптической и ЭПР-спектроскопии (методом непрерывного потока), получили прямые доказательства того, что свободные радикалы исчезают в результате дисмутации. При рН 4,8 образующийся в процессе реакции свободный радикал хлорпромазина обладает высокой стабильностью и может накапливаться в значительных количествах. Если затем повысить значение рН, то эти радикалы исчезают под влиянием дисмутации, причем константу скорости этой реакции можно измерить. Больше того,.’.этот метод позволил осуществить кинетические исследования реакции

АН” Соединение II————————- А Пероксидаза,

Которая протекает при низких значениях рН, когда дисмутации радикалов не происходит. Кинетика этой реакции для двух раз­личных концентраций пероксидазы представлена на фиг. 87,кото­рая слуяшт превосходной иллюстрацией того, ^и? аким образом кинетику таких ферментативных реакций можно разделить на две отдельные стадии и затем провести количественное исследование каждой из них.

Помимо кинетических измерений на свободных радикалах, возникающих в процессе пероксидазных реакций, были проведены также кинетические измерения ЭПР-иоглощения, обусловленного

Фиг. 87. Кинетика окисления хлорпромазина в присутствии пероксида-

I— концентрация перокеидазы 4-10-s М, II— 3,2-10–7 М. Обе кривые получены для одних и тех же концентраций хлорпромазина и перекиси водорода при рН 4,8. Можно видеть, что повышение концентрации перокеидазы приводит к значительному умень­шению времени релаксации.

Атомами железа в различных пероксидазах. Эти результаты сум­мированы в конце разд. 6.6.5 после обсуждения сигналов ЭПР, которые дает геминовое железо.

Пероксидаза, каталаза, анаэробные дегидрогеназы – Ферменты

При окислении субстрата NAD + превращается в восстановленную форму NADH, а второй протон субстрата диссоциирует в среду (NADH + Н + ). К анаэробным NAD-зависимым дегидрогеназам относятся такие ферменты, как алкогольдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа и др. Коферментом анаэробных дегидрогеназ может быть также NADP + (никотинамидадениндинуклеотидфосфат), содержащий на одну фосфатную группировку больше, чем NAD + . NADP- зависимыми дегидрогеназами являются изоцитратдегидрогеназа, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, 6-фосфоглюконатдегидрогеназа и др.

Субстратная специфичность фермента зависит от его белковой части. Многие NAD- и NADP-зависимые дегидрогеназы нуждаются в присутствии ионов двухвалентных металлов. Например, алкогольдегидрогеназа содержит ионы цинка.

Окисленные и восстановленные формы коферментов анаэробных дегидрогеназ могут взаимопревращаться в реакции, катализируемой ферментом NAD(Р)-трансгидрогеназой:

NADPH + NAD + = NADP + + NADH

Анаэробные дегидрогеназы передают водород, т. е. электроны и протоны, различным промежуточным переносчикам и аэробным дегидрогеназам.

Аэробные дегидрогеназы. Это также двухкомнонентные ферменты, получившие название флавиновых (флавопротеины).

Помимо белков, в их состав входит прочно связанная с ними простетическая группа — рибофлавин (витамин В₂).

Различают два кофермента этой группы: флавинмононуклеотид (FMN), или желтый дыхательный фермент Варбурга, и флавинадениндинуклеотид (FAD).

FMN (рибофлавин-5-фосфат) содержит гетероциклическое азотистое основание — диметилизоаллоксазин, спирт рибит (производное рибозы) и фосфат:

В FAD кроме FMN имеется еще один нуклеотид — аденозинмонофосфата:

Активной группой в реакции присоединения и отдачи электронов и протонов в FMN и FAD служит изоаллоксазин. Взаимодействие с восстановленным переносчиком, например NADH, происходит следующим образом:

Примером дегидрогеназы, в состав которой входит FAD, является сукцинатдегидрогеназа. Доноры электронов для аэробных дегидрогеназ — анаэробные дегидрогеназы, а акцепторы — хиноны, цитохромы, кислород.

Цитохромная система. Среди оксидаз очень важную роль играют железосодержащие ферменты и переносчики, относящиеся к цитохромной системе. В нее входят цитохромы ” и цитохромоксидаза. Включаясь в определенной последовательности в процесс переноса электронов, они передают их от флавопротеинов на молекулярный кислород.

Все компоненты цитохромной системы содержат железопорфириновую простетическую группу.

При переносе электронов цитохромами железо обратимо окисляется и восстанавливается, отдавая или приобретая электрон и изменяя таким образом свою валентность. В дыхательной цепи направление транспорта электронов определяется величиной окислительно-восстановительного потенциала цитохромов.

В этой системе передавать электроны непосредственно на кислород способна только цитохромоксидаза (цит. а + а3). Из всех известных оксидаз она имеет наибольшее сродство к кислороду. Ингибиторами цитохромоксидазы являются СО, цианид, азид. Б растительных митохондриях кроме цитохромоксидазы функционирует оксидаза, не подавляемая цианидом и названная альтернативной оксидазой. Например, в митохондриях початков ароидных активность цианидустойчивой оксидазы в 10 раз превышает активность цитохромоксидазы.

Пероксидаза и каталаза. К пероксидазам относят целую группу ферментов, использующих в качестве окислителя пероксид водорода: классическую пероксидазу, NAD-пероксидазу, NADP-пероксидазу, пероксидазу жирных кислот, глутатионпероксидазу, цитохромпероксидазу и др. Все они работают по следующей схеме, где А — субстраты:

В последние 2 — 3 десятилетия показана полифункциональность пероксидаз. Помимо пероксидазной, у них имеется оксидазная функция, т. е. способность переносить электроны в отсутствие пероксидного кислорода на молекулярный кислород. Пероксидаза может также функционировать как анаэробная дегидрогеназа, например NADH-дегидрогеназа, передающая электроны от восстановленных пиридиновых нуклеотидов на разные акцепторы.

Пероксид водорода, помимо пероксидазы, расщепляется также каталазой, в результате чего образуется молекулярный кислород. В реакции участвуют две молекулы пероксида, одна из которых функционирует как донор, а другая — как акцептор электронов (см. выше).

Простетической группой пероксидазы и каталазы служит гем, в состав которого входит атом железа.

Оксигеназы. Наряду с оксидазами, которые используют молекулярный кислород как акцептор электронов, в клетках широко представлены оксигеназы, активирующие кислород, в результате чего он может присоединяться к органическим соединениям. Ферменты, внедряющие в субстрат два атома кислорода, называют диоксигеназами, а присоединяющие один атом кислорода — монооксигеназами или гидроксилазами. В качестве доноров электронов оксигеназы используют NAD(P)H, FADH₂ и др.

Оксигеназы присутствуют во всех типах клеток. Они участвуют в гидроксилировании многих эндогенных соединений в частности аминокислот, фенолов, стеринов и др., а также в детоксикации чужеродных токсических веществ (ксенобиотиков).

Источники:

http://studopedia.ru/12_112154_I-oksidoreduktazi.html
http://msd.com.ua/elektronnyj-paramagnitnyj-rezonans-v-biologii/issledovaniya-katalazy-i-peroksidazy/
http://studfile.net/preview/5376007/page:3/