Культура in vitro пыльников яблони: достижения и перспективы

Кукуруза и культура in vitro: достижения и перспективы

Опубликовано пн, 07/03/2011 — 19:21 пользователем admin

Кукуруза – одна из ведущих злаковых культур, важна как пищевой, технический и кормовой продукт для человечества вообще. Однако, надо заметить, что генетическая вариабельность для коммерческого производства кукурузы, выращиваемой в зоне умеренного климата, ограничена. Абсолютное большинство генетического разнообразия кукурузы базируется на тропическом фотопериодочуствительном материале из Южной и Центральной Америки. С таким материалом сложно работать в зонах умеренного климата, к которым относится большая часть территории Украины. Следует отметить, что производство гибридной кукурузы базируется на гибридных семенах, которые имеют происхождение из ограниченного числа инбредных линий. Недостаточное генетическое разнообразие открывает путь к росту заболеваемости и ограничивает улучшения кукурузы умеренного климата. Актуальной научной проблемой является исследование возможностей создания нового исходного материала для генетико-селекционных нужд и коммерческого производства кукурузы биотехнологическим путем. Традиционными источниками наследственной изменчивости, которые используются в генетической селекционной практике кукурузы, является гибридизация с последующим отбором и мутагенез (спонтанный и индуцированный). Вместе с тем, в последнее время все большее значение стали иметь растения разных видов, созданные с помощью биотехнологических методов, базирующихся на использовании культуры in vitro растительных тканей: сомаклональной изменчивости, генетической инженерии, андрогенеза, клеточной селекции. То есть, активно ведется поиск новых нетрадиционных путей воздействия на геном растений с целью создания более продуктивных и устойчивых к неблагоприятным условиям генотипов растений.

Природа тотипотентности многих растительных соматических клеток и их способность выживать в культуре in vitro стимулирует интерес исследователей в получении растений в пробирке in vitro (Kranz, 2008; Dumac, 2008). Первые исследования базировались на поиске компонентов питательной среды, которые бы обеспечивали нормальный рост и развитие растительных клеток. Впоследствии акцент исследования сместился на изучение процессов, происходящих при развитии клеток. Было открыто культура каллуса – масса недифференцированных клеток, из которых происходит органогенез и эмбриогенез. Установлено, что влиять на дифференциацию клеток можно изменяя гормональный баланс. Сегодня растения получают из разных эксплантатов: незрелые зародыши, различные типы каллуса подлежащие эмбриогенезу.

Межродовые и межвидовые гибриды злаков и генетическая трансформация спермия в яйцеклетку имеют большой потенциал для совершенствования зерновых, расширения генетической базы с необходимым набором свойств. Культура in vitro, использующая гаметофитные ткани позволяет использовать широкую естественную базу генетического материала, которая в условиях in vivo имеет ряд пред-и пост-барьеров оплодотворения. Также, открываются возможности микроинъекций генетически трансформированных спермиев непосредственно в яйцеклетку, находящуюся в зародышевом мешке. Эти методы требуют успешного оплодотворения в искусственных условиях и доведения полученных зигот до зрелых фертильных растений.

В цветочных растениях зародышевый мешок представляет собой женскую гаметофитную генерацию. Этот гаметофит глубоко погружен в ткани семязачатка, что затрудняет манипуляции с ним (Leduc, 1995, Лаурие, 1999; He, 2004; Punwani, 2008; Higashiyama, 2008; Marton, 2008). К моменту оплодотворения, зародышевый мешок наиболее распространенного Polygonum-типа, вмещает яйцеклетку, две синергиды, центральную клетку с двумя полярными ядрами и три антиподы. После оплодотворения яйцеклетка дает начало зародышу, а центральная клетка – эндосперму. Клетки, которые входят в зародышевый мешок до и после оплодотворения, являются эмбрионально молодыми и обладают высокой степенью тотипотентности [Dumas, 2008]. Культура изолированных яйцеклеток, зигот, молодых зародышей, эндосперма и целых зародышевых мешков на разных стадиях развития составляет новое, перспективное, но мало разработанное направление биотехнологических исследований в области клеточной и генетической инженерии кукурузы.

В условиях in vivo все этапы развития зародыша от оплодотворения до проростка осуществляются как строго последовательная смена клеток и тканей, необходимой морфогенетической компетенции, и поэтому они вполне предсказуемы [Журавлев, 2008]. Многие особенности механизма регуляции морфогенеза у растений еще не вполне понятны, но на практике ими давно уже пользуются для получения заданного результата, т.е. для размножения растений традиционным путем. Несколько иная картина наблюдается в системах in vitro. Как правило, морфогенетическая компетентность клеток, которые служат стартовыми для преобразований in vitro, не вполне соответствует требуемому направлению развития. Поэтому даже если индукция морфогенеза состоялась, дальнейшее направление развития отдельной индуцированной клетки трудно предсказать. Существует несколько моментов, которые необходимо учитывать при моделировании системы in vitro [Тюкавин, 2007]. Считается, что решающую роль играет степень дифференциации клетки, которая непосредственно влияет на данное направление развития. Но так как это не связано с изменениями базовой структуры ДНК, поэтому могут быть проведены необходимые модификации. Благодаря этому удается индуцировать морфогенез в некомпетентных клетках. Другим важным условием, что приводит к непредсказуемости, является низкий уровень специфичности сигнала, который индуцирует начало морфогенетических преобразований. Такими сигналами-индукторами у растений могут быть разные биотические и абиотические факторы. Известны и другие примеры, которые можно толковать как проявление позиционной информации. Существуют свидетельства о повышении пролиферации путем ослабленного влияния окружающих клеток. То есть, речь идет о повышении или снижении дифференциации зародыша, в зависимости от того, с каким количеством клеток его было пересажено на искусственную питательную среду.

Статья по теме:   Ради чего стараться?

Автор статьи и фото в статье (кроме второго): Ляпустина Е.В.

Каллусо- и морфогенез пыльников иммунных к парше сортов яблони (Malus domestica Borkh. ) в культуре in vitro Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Джафарова В.Е.

Изложены результаты культивирования изолированных пыльников иммунных к парше сортов яблони орловской селекции. Показано, что развитие пыльников исследуемых сортов яблони проходит по пути косвенного андрогенеза. Интенсивность каллусогенеза определяется генотипом сорта, видом питательной среды и экзогенных стимуляторов роста. В каллусных тканях сортов Свежесть и Афродита индуцированы корни. Препарат пиклорам проявляет значительную ауксиновую активность в процессе каллусообразования из пыльников яблони как на свету, так и в темноте.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Джафарова В.Е.

Anther callusogenesis and morphogenesis of immune to scab apple varieties (Malus domestica Borkh.) in culture in vitro

The results of cultivating of isolated apple anthers of immune to scab varieties are described. The peculiarities of callus formation using picloram are shown.

Текст научной работы на тему «Каллусо- и морфогенез пыльников иммунных к парше сортов яблони (Malus domestica Borkh. ) в культуре in vitro»

КАЛЛУСО- И МОРФОГЕНЕЗ ПЫЛЬНИКОВ ИММУННЫХ К ПАРШЕ СОРТОВ ЯБЛОНИ (Malus domestica Borkh.) В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

В. Е. Джафарова, кандидат сельскохозяйственных наук

Государственное научное учреждение Всероссийский НИИ селекции плодовых культур, г. Орел, Россия

Введение. В прошлом столетии значительное развитие получил метод «андрогенеза», т.е. культивирование in vitro пыльников. Основной интерес вызван получением гаплоидных растений из пыльцы в культуре in vitro. Явление ^аплоидии было открыто в 1922 г. и первое гаплоидное растение Datura ctramo- nium было получено в том же году [1].

Уже к середине 30-х годов были получены и изучены десятки гаплоидов у разных видов растений. Тогда же были высказаны идеи о получении из гаплоидов абсолютно гомозиготных диплоидных линий и использовании их в селекции [2, 3].

Культивирование изолированных пыльников основано на развитии тысяч микроспор, каждая из которых может дать гаплоидное растение. Применение гаплоидных растений в селекции позволяет сегодня создавать константные не-расщепляющиеся гомозиготные формы в первой генерации, и таким образом со

кращать селекционный процесс на 3-4 генерации, характерные для обычной схемы селекции; упрощать мутационную селекцию, поскольку у гаплоидов отсутствует доминирование и все гены имеют фенотипическое проявление; получать каллусную ткань, содержащую не только гаплоидные клетки, но и клетки других уровней плоидности, что может быть дополнительным источником для селекции И,

Использование техники культивирования пыльников позволило создать целый ряд сортов риса, пшеницы, табака, ячменя и других культур. Удалось получить андрогенные растения многолетних плодовых культур: земляники,

яблони, цитрусовых [6-8].

Успешное использование культивирования in vitro пыльников и получение андрогенных гаплоидов однолетних и многолетних культур послужили причиной для подобных исследований с 2005г в ГНУ ВНИИСПК.

Методика исследований. Основной задачей наших исследований на начальном этапе являлось изучение особенностей каллусогенеза и возможности органогенеза сортов яблони иммунных к парше.

В работе использовали пыльники сортов яблони Орловское полесье, Афродита, Свежесть, Юбилей Москвы. В сухую погоду для посева пыльников бутоны отбирали по внешним признакам, считающимися для яблони наиболее продуктивными в отношении каллусооб-разования (бутоны выдвинуты, но плотно сомкнуты, без белого конуса, их пыльники зеленовато-желтого цвета). Их помещали в чашки Петри с увлажненной фильтровальной бумагой и ставили в холодильник на 3 дня при температуре +3-4°С.

Посев пыльников проводили на среду Мурасиге-Скуга и Хеллера для выявления лучшего каллусообразования. Работа по посеву пыльников проводилась в асептических условиях из расчета один бутон на пробирку. Посеянные пыльники культивировали в термостате при температуре 25°С в условиях 16 часового фотопериода с интенсивностью освещения до 1000 люкс и влажностью воздуха 60-70%.

Статья по теме:   Определение сортов и видов винограда

Среды, используемые для индукции каллусообразования и получения расте-ний-регенерантов, содержали макро- и микросоли, витамины В6, РР по 0,5 мг/л, гидролизат казеина 600-800 мг/л, мезоинозит — 100 мг/л, сахарозу — 20 г/л, и агар, концентрация которого варьировала в зависимости от его вида. В среды были включены еще стимуляторы роста: ауксины, цитокинины, гиббереллин. В группу использованных ауксинов вошли НУК, ИУК, 2,4-Д, пиклорам; в группу ци- токининов -кинетин и шесть БАП. Соотношение ауксин:цитокинин в индукции

каллусообразования равнялось 1:1.

Пиклорам в исследования включен в связи с его высокой ауксиновой активностью на многих однолетних культурах Он эффективнее ИУК и НУК в индукции образования каллуса; на эксплантах табака в сочетании с кинетином стимулировал образование почек [9]. При каллу- согенезе у бобовых и злаковых отмечена его более высокая стимулирующая активность по сравнению с 2,4-Д и значительно более низкая фитотоксичность

[10]. К тому же пиклорам в отличие от 2,4-Д не ингибирует синтез хлорофилла при выращивании каллусов на свету и поэтому более пригоден для получения органогенных каллусов [11].

Выбор пиклорама обусловлен был еще и тем, что при культивировании пыльников многолетних плодовых растений отмечен низкий выход каллусов и эмбриоидов, у отдельных генотипов вообще не удавалось получить регенеран- ты. К тому же данные по применению пиклорама в индукции каллуса и органогенеза у плодовых культур отсутствуют.

Пробирки с образовавшимся в темноте каллусом помещали в светокомнату с интенсивностью освещения до 1500 люкс в условиях 16-часового фотопериода. Через 10 дней каллусы переносили на питательные среды для индукции морфогенеза.

Результаты исследований. В зависимости от складывающихся весенних погодно-климатических условий и их влияния на формирование пыльников начало образования каллуса варьировало от 10 дней до четырех недель в темноте и от двух до семи недель на свету. Частота каллусообразования пыльников изучаемых сортов яблони различалась по годам: наибольшей она была в 2006 г. и находилась в пределах 57,0-93,1% при формировании каллуса в темноте. На свету данный показатель варьировал от 12,5 до 63,4%. Наименьшее каллусооб- разование по сортам было в 2007 г. и составило от 26,0 до 71,4% в темноте, 13,0-31,7% — на свету (табл. 1).

Установлено, что каллусогенез зависит прежде всего от генотипа исходного растения. Наибольшая частота каллу-согенеза была характерна для сортов Свежесть и Юбилей Москвы (72,5- 90,6%). Оба сорта такие показатели проявили на среде Хеллера. Ниже уровень каллусообразования отмечен у сортов Афродита и Орловское полесье. Образовавшиеся каллусные ткани (косвенный андрогенез) различались плотностью и цветом. В основном это были морфогенные каллусы плотной консистенции с бугристой поверхностью. Цвет их варьировал от белого до желтоватого. В единичных случаях встречались каллусы рыхлые, водянистые, молочно- белого цвета.

Эффективность каллусообразования пыльников яблони в культуре in

Сорт Питательная Количество экспланти- Частота каллусообразо-

Яблони in vitro

Плоды науки на предприятии «Зеленые линии — Калуга».

Д. Н. Митин, руководитель направления «Садоводство»; Л. В. Фролова, канд. с.-х. наук, руководитель лабораторно-питомниководческого центра безвирусных растений, ООО «Зеленые линии — Калуга»

Группа компаний «СОЮЗСНАБ», основанная в 1991 году, является одним из крупнейших производителей и поставщиков ингредиентов для различных фирм России и стран ближнего зарубежья. Предприятие постоянно стремится осваивать новые направления деятельности, расширять собственное производство и ассортимент продукции.

Сегодня одним из таких важнейших направлений для Группы компаний является сельское хозяйство, в частности садоводство и овощеводство. В данных отраслях ведутся различные научные разработки и исследования, а также осуществляется собственное производство высококачественной продукции на основе входящего в состав ГК «Союзснаб» предприятия «Зеленые линии — Калуга».

Работа компании началась в 2009 году. Сегодня она располагает 6400 га пахотной земли, 320 га садов, а также мощностями для осуществления основного вида деятельности — выращивания саженцев и семенного материала для аграрных хозяйств и плодопитомников. Производство продукции происходит на базе лаборатории клонального микроразмножения и управляемых теплиц для доращивания оздоровленного посадочного материала, общий размер которых составляет 1700 кв. м, сертифицированного питомника плодовых деревьев площадью 27 га и участка для выращивания оригинальных и элитных семян картофеля. Компания ежегодно производит порядка 1,5 млн безвирусных микрорастений и 300 тыс. саженцев. Достижению подобных результатов способствовали научный подход и использование новейших технологий, в частности современный метод клонального микроразмножения подвоев и сортов, позволяющий получить безвирусную здоровую экологическую продукцию. Основным партнером предприятия по проведению совместных исследовательских работ в сфере создания генетического банка оздоровленных сортов яблони и депонирования микрорастений является ООО НПП «Микросад» — резидент ИЦ «Сколково».

В СТЕРИЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ

Процесс получения саженца начинается с клонального микроразмножения, осуществляемого в специальной лаборатории. Технология заключается в получении in vitro, то есть в стерильных условиях, вегетативным способом растений, генетически идентичных исходному материалу, благодаря чему за короткое время удается получить оптимальное количество микропобегов. Для достижения результата меристематическая ткань вычленяется из вегетативной почки под микроскопом, после чего для культивации помещается в разные по гормональному статусу питательные среды. Перед выведением обязательно проводится тестирование растения на вирусы, поскольку для всех культур характерен свой набор вирусов, влияющих как на внешний вид, так и на обменные процессы, фотосинтез, репродуктивность и качество урожая. На каждом этапе культивирования осуществляется жесткий контроль качества. Микрорастения, полученные в культуре in vitro, считаются оздоровленными, имеют более высокий морфогенетический потенциал, являются ювенильными, быстро наращивают вегетативную массу и раньше вступают в пору плодоношения. Таким образом, выводимые в компании саженцы способны плодоносить на год раньше, а подвои отличаются более высокой побегообразовательной способностью.

Статья по теме:   АЗОС-2 - виноградный подвой

Адаптация микрорастений к нестерильным условиям, а затем их доращивание, во время которого используются только биологические препараты, осуществляется в теплицах. При этом компанией была разработана специальная система доращивания саженца с сокращением срока его формирования на год посредством проведения микропрививки. Для ее приживаемости важно создать определенные условия, поэтому в теплицах все растения находятся на капельном и капиллярном поливах. Благодаря подобной методике предприятию удается выпускать полукарликовые сортовые саженцы, которые доращиваются в открытом грунте до пригодности к высадке в сад. Несмотря на большой объем производимых в год саженцев — от 300 до 800 тыс. штук, — компания ведет постоянную оптимизацию своей технологии с применением различных научных разработок. На определенных этапах выращивания оздоровленного материала осуществляется контроль методом ИФА на отсутствие вирусов, которые могут наносить серьезный ущерб насаждениям.

Сегодня коллекция сортов яблони in vitro лаборатории компании включает более 15 сортов, среди которых «Болотовское», «Ветеран», «Веньяминовское», «Избранница», «Солнышко», «Алеся», «Поспех», «Брянское золотистое», «Московское красное», «Беркутовское», «Свежесть», «Кандиль», «Ренет Симиренко» и другие, и пять подвойных форм — 54-118, 57-545, 62-396, 76-8-13 и 76-6-13. Кроме перечисленных сортов предприятие имеет возможность культивировать любые сорта и подвои на заказ. В этом заключается не только коммерческий интерес компании, но и научно- производственный, ведь каждый сорт ведет себя в лабораторных условиях индивидуально и нередко требует к себе особого внимания. Кроме яблоневых саженцев ООО «Зеленые линии — Калуга» ежегодно выгоняет рассаду оздоровленной земляники, гибриды ежевики, малины и другие. Сейчас в стадии отработки находятся технологии для массового производства других ценных плодовых и декоративных культур.

Другое направление деятельности ООО «Зеленые линии — Калуга» — оригинальное и элитное семеноводство картофеля. Процесс создания семенного материала начинается с черенкования базовых микрорастений в лаборатории, затем происходит культивация в световой комнате, после которой культура высаживается в специальный торфяной грунт и размещается в теплицах с капельным поливом и оптимально подобранными режимами температуры и воздухообмена. Именно защищенный грунт позволяет получить гарантированно безвирусные клубни для их высадки на дальнейшую репродукцию — так называемое первое полевое поколение, а затем для получения различного элитного семенного материала. При этом компания осуществляет строгий контроль качества семян на каждом этапе культивации — проводит тестирование на вирусы, клубневой анализ и сертификацию. Объемы производства мини-клубней в условиях защищенного грунта составляют 1,5–2 млн штук. Предприятие выращивает множество сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции: «Инноватор», «Красавчик», «Ред Скарлетт», «Удача», «Метеор», «Брянский надежный», «Брянский деликатес», «Розара», «Фелокс», «Леди Клер», «Даренка», «Пикассо», «Фаворит» и другие. С этого года начались испытания новых ирландских сортов этой клубненосной культуры.

ОПТИМИЗАЦИЯ И РАЗВИТИЕ

Компания «Зеленые линии — Калуга» постоянно развивается и совершенствует используемые технологии. К примеру, за последний год были пересмотрены многие технологические операции, выбраны и найдены оптимальные пути увеличения производительности труда. Участие человека в процедуре приготовления питательных сред было существенно сокращено, а также повышена автоматизация процессов подготовки посуды для них. Оптимизация технологии помогла увеличить выпуск микрорастений из лаборатории в теплицы комплекса до 300 тыс. штук, а к концу года планируется увеличить данный показатель еще на 400 тыс. саженцев. В этом году компания также запускает новые автоматизированные теплицы площадью 2000 кв. м, что позволит дополнительно разместить не менее 250 тыс. саженцев. Система микроклимата в тепличном комплексе даст возможность осуществлять культурооборот в зимний период, а также выращивать землянику на ягоду.

Уже сегодня ООО «Зеленые линии — Калуга» производит посадочный материал и сотрудничает со многими аграрными предприятиями страны, среди которых ООО «Нацагроэкопроект», АО «Крымская Фруктовая Компания» и другие. Научный подход, соблюдение технологических требований, жесткий контроль на всех этапах производства продукции позволяют компании по каждому направлению ее деятельности получать высококачественный посадочный материал.

Источники:

http://bio-x.ru/articles/kukuruza-i-kultura-vitro-dostizheniya-i-perspektivy
http://cyberleninka.ru/article/n/17279407
http://www.nsss-russia.ru/2018/03/23/%D1%8F%D0%B1%D0%BB%D0%BE%D0%BD%D0%B8-in-vitro/

Ссылка на основную публикацию

Adblock
detector