Культивирование in vitro и регенерация из соматических тканей сливы домашней

Вспомогательные методы in vitro в селекции растений

Оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости) проводят при невозможности осуществить оплодотворение между выбранными парами растений в естественных условиях. Необходимость применения может быть вызвана как физиологическими (несоответствие во времени созревания пыльцы и т. п.), так и морфологическими (короткая пыльцевая трубка или блокирование ее роста на разных этапах развития и т. п.) причинами.

Оплодотворение in vitro можно осуществить культивированием завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой на искусственной агаризованной питательной среде.

Визуально определить, прошло оплодотворение in vitro или нет, можно по быстро увеличивающимся в размерах семяпочкам. Сформировавшийся зародыш, как правило, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению.

Плацентарное оплодотворение in vitro позволило преодолеть несовместимость в скрещивании сортов культурного табака N. tabacum с дикими видами N. rosulata и N. debneyi и сделало возможным получение межвидовых гибридов табака.

Преодоление постгамной несовместимости. Постгамная несовместимость при отдаленной гибридизации возникает после оплодотворения. Часто при этом образуются щуплые невсхожие семена. Причиной может быть расхождение во времени развития зародыша и эндосперма. Из-за слабого развития эндосперма зародыш становится неспособным к нормальному прорастанию. В таких случаях из зерновки изолируют зародыш и выращивают его в питательной среде. Данный способ выращивания называется эмбриокультурой. Питательная среда для выращивания может быть простой, без добавок физиологически активных веществ (например, среда Уайта) или любой другой, содержащей минеральные соли и сахарозу.

При отдаленных скрещиваниях уже на ранних этапах могут наблюдаться нарушения в развитии зародыша, что выражается в отсутствии дифференцировки, замедленном росте. В этом случае рост культур зародыша состоит из двух этапов — эмбрионального роста зародыша, во время которого продолжается его дифференцировка, и прорастания подросшего зародыша. Для первого этапа требуется более сложная по составу питательная среда: с повышенным содержанием сахарозы, с добавками различных аминокислот, витаминов и гормонов.

Применение метода эмбриокультуры в селекции приобретает в последнее время большое значение для получения отдаленных гибридов зерновых, злаковых и других сельскохозяйственных культур. Показана возможность увеличения выхода пшенично-ржаных гибридов путем доращивания незрелых зародышей, а также использования эмбриокультуры для преодоления постгамной несовместимости при гибридизации пшеницы с колосняком.

Метод эмбриокультуры находит все более широкое применение в межвидовой гибридизации овощных растений. Для лука разработаны приемы выращивания in vitro абортивных зародышей из гибридных семян с разных этапов эмбриогенеза, а также приемы выращивания зародышей от частично фертильных межвидовых гибридов. Культуру изолированных зародышей используют в селекции томатов и других овощных растений.

Этот вспомогательный метод применяют не только при отдаленной гибридизации, но и для преодоления постгамной несовместимости, а также с целью микроразмножения ценных гибридов. В этом случае микроразмножение идет путем каллусогенеза, индукции морфогенеза и получения растений-регенерантов из каллусной ткани. Техника клонирования незрелых зародышей позволяет размножать ценные генотипы растений на ранних стадиях жизненного цикла. Еще одна возможность применения культуры зародышей — использование ее в клеточной селекции.

Клональное микроразмножение отдаленных гибридов. Эмбриокультура дает возможность вырастить гибридные растения из неполноценных зародышей. Однако выход гибридных растений мал и гибриды часто бывают стерильны. Иногда, например при селекции гречихи, трудно воспроизвести в потомстве уникальные генотипы из-за перекрестного опыления культуры. Поэтому перед исследователями часто встает задача размножить и сохранить полученные растения. В этом помогает метод клонального микроразмножения. Размножают гибриды путем активации развития меристемы пазушных почек (черенкованием стерильных побегов), адвентивными почками или регенерацией растений из кал- лусной ткани, в частности полученной при культивировании зародышей.

Получение гаплоидных растений in vitro и использование их в селекции. Роль гаплоидных растений в селекции очень велика. Их применение позволяет быстрее найти нужную комбинацию, сокращает время для создания сорта. Гаплоидные растения используют для получения стабильных гомозиготных линий. Для мутагенеза также удобнее использовать гаплоиды, поскольку на гаплоидном уровне облегчается отбор рецессивных мутаций.

В диплоидных растениях мутации редко затрагивают оба аллельных гена в гомологичных хромосомах. Особь обычно гетерозиготна (два гена различаются), при этом проявляется действие только доминантного (но не рецессивного) гена. Поскольку мутации чаще рецессивны, чем доминантны, их довольно сложно выявить. В гаплоидных же растениях, которые содержат только одну из каждой пары гомологичных хромосом, мутации проявляются немедленно. Селекция на гаплоидном уровне позволяет вести прямой отбор не только доминантных, но и рецессивных признаков.

Гаплоидные особи стерильны, но можно искусственно удвоить набор их хромосом с помощью колхицина и получить диплоидные гомозиготные растения.

Гаплоиды могут возникать спонтанно, но частота их спонтанного возникновения очень мала. Искусственным путем с использованием методов in vitro удается получить большие количества гаплоидных растений.

Существует три способа получения гаплоидов с использованием метода культуры изолированных тканей:

  • андрогенез — получение гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных пыльников и микроспор;
  • гиногенез — получение гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных семяпочек;
  • партеногенез — получение гаплоидов из гибридного зародыша, у которого из-за несовместимости хромосом родителей потеряны отцовские хромосомы.

Гаплоидные эмбриоиды, образовавшиеся в результате элиминации хромосом отцовского генома, культивируют на искусственных питательных средах и получают гаплоидные растения.

Возможны два пути образования гаплоидных растений в культуре пыльников:

  • образование растений путем эмбриогенеза в пыльцевых зернах. При этом внутри пыльников из отдельных пыльцевых зерен возникают эмбриоиды. Они прорастают и дают гаплоидные растения;
  • образование каллуса из клеток пыльника. В дальнейшем в результате морфогенеза из каллусных клеток регенерируют растения. В этом случае образовавшиеся растения не всегда бывают гаплоидными и часто отличаются по плоидности. До конца не выяснено, образуются ли они от полиплоидизированных гаплоидных клеток или от слившихся клеток.

Гаплоиды, полученные in vitro, можно применять не только в практической селекции, но и в генетической инженерии, в клеточной селекции. Пыльцевые зерна являются в некоторых случаях более удобными, чем протопласты, объектами для опытов по генетической трансформации.

Условия и методы культивирования тканей in vitro

Любая ткань растений — это сообщество клеток, и если она изолирована (выделена) из целого организма, то лишена его регулирующего воздействия и питания. Следовательно, одним из принципов метода культуры тканей (клеток) является воспроизведение in vitro условий, близких или идентичных тем, в которых клетки находятся на материнском растении, для обеспечения их полноценного питания и развития.

Статья по теме:   Косой кордон - виноград

Тогда при строгом соблюдении этих условий в культуре тканей размножаются (регенерируют) идентичные исходному генотипу клетки и растения. Это одно из направлений использования. Однако если такие условия достигаются и воспроизводятся не в полной мере, то клетка оказывается в относительно иных физико-химических условиях, что приводит к временному и качественному изменению в реализации ее генетической информации.

Смещая в эксперименте временную реализацию генетической информации (с помощью гормональных воздействий), можно наблюдать ее модификацию, а под влиянием различных экстремальных трансформирующих факторов возможно ее изменение в нужном направлении. Клетка в условиях культуры in vitro проявляет цитогенетическую неустойчивость, в результате этого возникают клетки с генетической гетерогенностью, появляются мутанты с измененным морфогенезом, которые могут быть исходным материалом для селекции.

Состав питательных сред и роль их отдельных компонентов

Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям неорганические элементы: макроэлементы в миллимолярных концентрациях (азот, фосфор, калий, кальций, магний, сера), микроэлементы — в микромолярных (железо, бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.), а также органические элементы: витамины, углеводы, аминокислоты и другие (например, гидролизат казеина, мезоинозит и др.).

В зависимости от консистенции существует деление на жидкие и твердые питательные среды.

Для приготовления твердых питательные сред используют агар-агар (0,7-1 %), который представляет собой полисахарид, получаемый из морских водорослей. Обычная его концентрация — 8-10 г на литр среды. Агар обеспечивает диффузию питательных элементов из среды в культивируемые ткани. Вместо агара можно использовать биогели.

Необходимо учитывать, что клетки растений и отдельные компоненты среды (витамины, фитогормоны, агар) чувствительны к определенным концентрациям водородных ионов. Например, агар в кислой среде теряет способность образовывать гель. В зависимости от объектов культивирования рН среды может варьировать от 5,2 до 6,6.

Неорганические элементы. Для роста растений в первую очередь необходимы углерод, кислород и водород. Если кислород и водород присутствуют в воздухе, то источником углерода для культуры изолированных тканей являются органические соединения. Но кроме этого для обеспечения полноценного метаболизма и его регуляции в изолированной культуре необходим ряд макро- и микроэлементов неорганического происхождения.

Макроэлементы присутствуют в среде в концентрациях порядка 10 М. Наиболее значимы из них азот, фосфор, натрий, калий, магний, кальций и сера.

Микроэлементы составляют в среде концентрации 10-6 М. Присутствие их обязательно при культивировании ткани в жидкой среде. По некоторым данным, отсутствие микроэлементов уменьшает интенсивность роста на 40 % в первом пассаже и приводит культуру к гибели в течение двух следующих пересадок. На агаризованой среде растения не так остро реагируют на отсутствие микроэлементов, так как в агаре содержатся многие микро- и некоторые макроэлементы.

Наиболее важными микроэлементами являются железо и медь, потому что они участвуют в регуляторных процессах и окислительно-восстановительных превращениях, входят в состав важных коферментов. Далее следуют марганец, цинк, молибден, кобальт и бор.

Органические составляющие сред. Согласно многочисленным данным, хорошим источником азота является мочевина, особенно для тканей подсолнечника, табака, топинамбура и др.

В качестве дополнительного источника азота в состав сред добавляют аминокислоты (а-аланин, глутаминовую кислоту, глицин, аргинин, аспарагиновую кислоту) или гидролизат казеина — источник аминокислот.

В культуре изолированных тканей растений действие аминокислот значительно варьирует для разных тканей и разных физиологических состояний вводимых в культуру эксплантов. Полностью заменить нитраты как источник азота способны аланин, аргинин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты, гликокол, аспарагин, пролин.

Формы аминокислот также по-разному влияют на рост: D-формы -токсичны, L-формы — пригодны. Аминокислоты, внесенные в питательную среду в дополнение к нитратам, могут оказывать стимулирующее, угнетающее и формативное действие на рост культуры тканей. Это зависит как от самой аминокислоты, так и от ее содержания в среде.

Очень часто исследователи заменяют смесь аминокислот гидрлизатом казеина. Последний способен увеличивать содержание никотина в культурах табака и подавлять биосинтез липидов во многих каллусных и суспензионных культурах.

Углеводы являются необходимым компонентом питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей растений, так как в большинстве случаев последние неспособны к автотрофному питанию.

Культуры тканей, даже зеленеющие на свету, не автотрофны в отношении углеводного питания. При изолировании и помещении на питательную среду кусочков хлорофиллоносных тканей они, как правило, теряют хлорофилл.

При выращивании на свету одни ткани остаются лишенными хлорофилла (галловая опухоль партеноциссуса, ткани сердцевинной паренхимы табака и др.). Другие ткани зеленеют на свету, но не способны обеспечивать себя полностью углеводами за счет фотосинтеза, и их необходимо выращивать на питательной средах, содержащих сахар.

При помещении кусочка ткани, изолированного из растения, на питательную среду без сахара его содержание в ткани начинает уменьшаться.

Трата сахаров зависит от сезонных изменений в самой ткани (ткани, взятые весной, теряют сахаров больше) и от содержания ауксинов в среде. При образовании каллуса старая ткань быстро теряет сахара, а в новообразующейся их количество возрастает. При помещении ткани на питательную среду, снабженную сахаром, ткани поглощают и трансформируют сахара. Количество поглощенного сахара и в особенности его превращения в другие формы зависят как от источника сахаров в среде, так и от типа ткани.

Наилучшим источником углеродного питания для большинства тканей является сахароза, обычно применяемая концентрация ее в питательной среде составляет 2-5 %. Чаще всего в качестве углеводов используют сахарозу в концентрации 3 %. Помимо сахарозы в качестве источника углеродного питания можно использовать глюкозу, фруктозу, галактозу и др. После сахарозы наиболее употребляемым источником углеродного питания для культивирования тканей растений является глюкоза. Из 33 исследованных культур (травянистых и древесных) 85 % имели отличный и хороший рост на среде с глюкозой.

На третьем месте по эффективности использования культурами тканей растений стоит фруктоза. Ее успешно используют для своего роста 2/3 культур фруктозу. Галактоза заметно отличается от глюкозы и фруктозы по действию на рост изолированных тканей растений. Более половины изученных культур почти не используют галактозу для роста. Однако есть данные, отмечающие положительную роль галактозы для культивирования тканей и органов растений.

В отличие от изолированных корней, которые могут расти только на среде с сахарозой, другие ткани, обладающие активными гидролитическими ферментами, могут использовать для питания самые разнообразные сахара и полисахариды. Способность ткани усваивать те или иные сахара зависит от ее происхождения. Перенос ткани с более бедной сахаром среды на более богатую обычно не вызывает нежелательных явлений, обратный перенос приводит к некрозам тканей.

Основное действие сахарозы состоит в увеличении уровня образования метаболитов, использование исходно повышенных концентраций сахарозы обычно приводит к росту выхода вторичных метаболитов в культурах. Влияние изначально высоких концентраций сахарозы, вероятно, состоит в увеличении осмотического потенциала среды.
Необходимо отметить влияние условий стерилизации на действие сахаров. При автоклавировании сахароза дает следы глюкозы и фруктозы, а в среде с сахарозой, которая не подверглась специальной очистке, наблюдается образование веществ, стимулирующих рост тканей.

Статья по теме:   Миллениум мускат - новый сорт винограда Австралии - виноград

Выращивание хлорофиллоносных и лишенных хлорофилла тканей на свету или в темноте изменяет как содержание растворимых сахаров в ткани, так и соотношение разных их групп. Различия в спектральном составе света также сказываются на углеводном метаболизме тканей.

Витамины принадлежат к активным веществам, играющим существенную роль в культуре тканей. Известно, что в процессе роста растения синтезируют необходимое им количество витаминов. Несмотря на это, исследования показывают, что при внесении витаминов в питательную среду рост ткани улучшается. Большая часть витаминов входит в состав ферментов, катализирующих многие метаболически важные реакции. Витамины делятся на водорастворимые и жирорастворимые.

В состав сред чаще всего включают водорастворимые витамины: тиамин, рибофлавин, биотин, пантотеновую кислоту, пиридоксин, аскорбиновую кислоту. При внесении полной смеси витаминов стимулирующее действие может определяться синергизмом между отдельными витаминами. По наблюдениям Хендерсона, смесь витаминов наиболее активна после слабого роста ткани в предыдущем пассаже.

Действие витаминов на рост культуры тканей зависит от способности ткани синтезировать их в оптимальном или субоптимальном количестве и от состава других компонентов питательной смеси, с которыми витамины могут взаимодействовать синергически или антагонистически. Интересно, что клеточная суспензия, полученная путем помещения ткани в жидкую среду, при пассировании значительно более чувствительна к недостатку витаминов, чем сама ткань. Исключение из среды холина и аскорбиновой кислоты приводит к увеличению одиночных суспендированных клеток. Следует отметить, что в каждом конкретном случае место отдельного витамина в сложной цепи метаболизма различно.

Клетки растений и животных более чувствительны, чем микроорганизмы, к присутствию посторонних ингредиентов, поэтому требуют химически чистых компонентов среды.

Вместе с тем некоторые питательные среды содержат натуральные биологические добавки: жидкий эндосперм кокосового ореха (кокосовое молоко), каштана, картофельный отвар и др. Они являются поставщиками более сбалансированных питательных компонентов по сравнению с искусственными средами.

В целях предотвращения возможного бактериального и грибного загрязнения в среды добавляют иногда такие антибиотики, как полиены (амфотерицин В, нистатин), карбенициллин, цефалоспорин и его производные, левомицитин, аминогликозиды (гентамицин сульфат, канамицин моносульфат), рифамгащин и др. Большинство антибиотиков неустойчиво при нагревании, поэтому их растворы стерилизуют фильтрацией через мембраны.

Наличие макро- и микроэлементов в составе культуральных сред определяется потребностями объектов культивирования. Широко применяемые в настоящее время среды Гамборга В5 и Мурасиге и Скуга (МС) (табл. 4.1, табл. 4.2) содержат по сравнению со средами Уайта значительно большие количества калия, фосфора и микроэлементов.

В настоящее время существует большое количество различных прописей питательных сред для культивирования изолированных тканей и клеток. Их состав зависит от задач культивирования, видов растений и типов эксплантов. Наиболее часто используемая среда Мурасиге и Скуга, впервые была составлена и предложена в 1962 г. Кроме того, в настоящее время широко известны среды Уайта, Нича, В5, N6 и др. (табл. 4.1), отличающиеся набором отдельных составляющих компонентов и их соотношением. Существуют и коммерческие препараты питательных сред, выпускаемые иностранными и российскими фирмами.

МС — самая универсальная среда, пригодная для образования и роста каллуса, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений. Среда Гамборга и Эвелега применима для бобовых растений и злаков. Среда Уайта обеспечивает укоренение побегов и нормальный рост стебля после регенерации. Среда Нича рекомендуется для индукции андрогенеза в культуре пыльников.

Индукция морфогенеза в культуре соматических тканей сливы домашней: Prunus domestica L. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Муратова, Светлана Александровна

  • Специальность ВАК РФ 03.00.23
  • Количество страниц 186

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Муратова, Светлана Александровна

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1. Регенерация растений из соматических тканей Prunus.

1.1.1 .Клональное микроразмножение косточковых культур in vitro.

1.1.1.1. Введение в культуру.

1.1.1.2. Субкультивирование побегов.

1.1.1.3. Укоренение побегов.

1.1.1.4. Перевод растений в нестерильные условия.

1.1.2. Индукция морфогенеза из изолированных тканей.

1.1.3. Подбор оптимальных условий регенерации.

1.1.4. Генетическая стабильность растений, полученных методами культуры тканей.

1.2. Агробактериальная трансформация Prunus.

1.2.1. Agrobacterium — естественные векторы переноса генетической информации в растения.

1.2.2. Механизм вирулентности агробактерий.

1.2.3. Конструирование обезоруженных векторов, промоторы, селективные и репортерные гены.

1.2.4. Генетическая трансформация Prunus с использованием векторной системы Agrobacterium.

1.2.5. Регенерация трансгенных растений.

1.2.5.1. Выбор экспланта.

1.2.5.2. Действие трансформационного/селекционного стресса наэксплант.

1.2.6. Перспективы генетической инженерии в селекции сливы.

ГЛАВА 2. Цели и задачи исследований.

ГЛАВА 3. Объекты и методы исследований.

3.1. Объекты исследований.

3.2. Культивирование сливы in vitro.

3.3. Регенерация сливы из листовых и стеблевых эксплантов.

3.4. Определение чувствительности к антибиотикам листовых тканей.

3.5. Бактериальные штаммы и плазмиды.

3.6. Трансформация листовых эксплантов и селекция каллусных клонов.

3.7. Определение GUS-активности в трансгенных клетках.

3.8. Статистическая обработка результатов исследований.

ГЛАВА 4. Результаты исследований.

4.1. Культивирование сливы in vitro

4.1.1. Введение в культуру.

4.1.2. Субкультивирование побегов.

4.1.3. Укоренение микрочеренков и перевод растений в нестерильные условия.

4.2. Регенерация сливы домашней из стеблевых и листовых эксплантов.

4.2.1. Некоторые особенности морфогенеза в культуре листовых дисков косточковых.

4.2.2. Влияние минерального состава’среды на эффективность регенерации из листовых эксплантов сливы домашей.

4.2.3. Влияние регуляторов роста растений на индукцию морфогенеза в культуре листовых тканей сливы домашней

4.2.4. Влияние вида и концентрации углевода в среде на частоту регенерации побегов из листовых эксплантов сливы домашней.

4.2.5. Оценка регенерационного потенциала сортов сливы домашней.

4.2.6. Изменение морфогенетического потенциала в зависимости от типа и происхождения экспланта.

4.2.7. Влияние ориентации эксплантов на среде на каллусообразование и органогенез в культуре высечек листьев сливы домашней.

4.2.8. Сравнение морфогенетического потенциала высечек листьев, полученных in vivo и in vitro.

4.3. Чувствительность к антибиотикам листовых тканей сливы.

4.4. Образование и рост трансформированного каллуса на селективных средах.

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биотехнология», 03.00.23 шифр ВАК

Совершенствование селекционного процесса плодовых и ягодных растений на основе цитологических методов и культуры изолированных тканей 2008 год, доктор сельскохозяйственных наук Расторгуев, Сергей Леонидович

Оптимизация процессов регенерации при размножении клоновых подвоев и сортов яблони и груши in vitro 2008 год, кандидат сельскохозяйственных наук Матушкина, Ольга Васильевна

Изучение регенерационной и трансформационной компетентности сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) и создание трансгенных растений, устойчивых к гербициду Баста 2007 год, кандидат биологических наук Мишуткина, Яна Владимировна

Биотехнологические методы в системе производства оздоровленного посадочного материала и селекции плодовых и ягодных растений 1998 год, доктор сельскохозяйственных наук Высоцкий, Валерий Александрович

Генно-инженерные методы в селекции груши обыкновенной (Pyrus communis L.) на устойчивость к биотическим и абиотическим факторам 2000 год, кандидат биологических наук Лебедев, Вадим Георгиевич

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Индукция морфогенеза в культуре соматических тканей сливы домашней: Prunus domestica L.»

Плоды косточковых культур, имея высокие пищевые и диетические свойства, занимают важное место в нашем рационе. Однако потребительский спрос на них в последнее время часто оказывается неудовлетворенным по ряду причин, в том числе из-за сильного подмерзания в неблагоприятные зимы, снижения урожайности в связи с распространением ряда опасных грибных и вирусных болезней.

Статья по теме:   Сорт винограда Молинара

Двадцатый век ознаменовался процессом быстрой смены сортимента косточковых культур. Значительно обогатился и сортимент сливы. Выведенные отечественными селекционерами новые сорта сочетают достаточно высокую зимостойкость с хорошими вкусовыми качествами плодов. Это Ренклод Харитоновой, Этюд, Заречная ранняя (ВНИИГиСПР), Смолинка, Яичная синяя (ВСТИСП), Теньковская синяя, Ренклод Теньковский (Татарский НИИСХ) и другие. Однако они не полностью адаптированы к климатическим условиям средней зоны плодоводства России и для создания на их основе промышленных садов необходима разработка специальных технологий.

Чтобы слива стала промышленной культурой в средней полосе России и в Поволжье, необходимо создание высокоадаптивных сортов, пригодных для интенсивных технологий возделывания, устойчивых к комплексу экстремальных факторов среды, прежде всего, зимостойких и устойчивых к основным болезням (шарка, бактериоз и др.), кроме того, обладающих высокими товарными и вкусовыми качествами. Для решения этих задач возникает настоятельная потребность в использовании новых технологий, позволяющих существенно сократить сроки получения новых форм и преодолеть трудности, связанные с половой несовместимостью при отдаленной гибридизации растений. В основе современных биотехнологических подходов лежат методы культивирования растительных тканей и органов в стерильных условиях.

По мнению Г.В. Еремина (1999), успешное выполнение программы производства плодов косточковых культур возможно, прежде всего, при условии 6 создания системы производства высококачественного посадочного материала, включающего обеззараживание, сертификацию сортов, клональное микроразмножение сортов и клоновых подвоев.

За последние 10-15 лет появилось ряд работ, в которых разрабатываются методы клонального микроразмножения растений рода Prunus. В то же время требуют детального выяснения сортовые особенности сливы домашней на разных этапах культивирования и связанные с ними вопросы повышения коэффициента размножения, укореняемости побегов и эффективности перевода полученных растений в нестерильные условия. Отработка метода клонального микроразмножения ряда районированных и перспективных сортов сливы

Одним из важнейших направлений селекции в настоящее время является генетическая инженерия растений. Методы генетической инженерии позволяют переносить в геном растений, в частности, в плодовые и ягодные культуры, единичные гены, контролирующие ряд хозяйственно-ценных признаков. При этом исключается перенос сопутствующего генетического окружения, что имеет место, например, при отдаленной гибридизации растений и, следовательно, отпадает потребность в длительных возвратных скрещиваниях. Новая технология уже сейчас позволяет решить ряд классических для традиционной селекции проблем. Получены формы плодовых и ягодных растений устойчивые ко многим вирусам (трансформация генами синтеза белков оболочки вирусов, антисмысловых конструкций вирусных РНК, вирусных РНК-зависимых полимераз), грибным и бактериальным патогенам (трансформация генами дефензинов, хи-тиназ, пептидных белков), некоторым вредным насекомым (перенос в растения 7 генов 5-эндотоксинов B.thuringiensis, генов-ингибиторов протеиназ), гербицидам неселективного действия (глифосату, фосфинотрицину, хлорсульфуроно-вым и другим гербицидам). Возможно получить растения с измененным вкусом (ген тауматина II) и с увеличенной продолжительностью хранения плодов (антисмысловые РНК гена полигалактуроназы и ферментов биосинтеза этилена), с повышенной способностью к вегетативному размножению и измененной архитектоникой (ген rolC A.rhizogenes, биосинтеза ауксинов A.tumefaciens под контролем соответствующих промоторов) и многими другими хозяйственно-ценными признаками.

Прошедшие полевые испытания трансгенные сельскохозяйственные растения, устойчивые к экологически безопасным гербицидам, насекомым, вирусам вытесняют исходные аналоги сортов и в некоторых странах (США, Канада) начинают доминировать среди культур, для которых такие трансгенные формы получены. По данным международной службы по применению агробиотехно-логических разработок динамика распространения трансгенных растений следующая: 1996 -2,2; 1997 — 12,1; 1998 — 30-32; 1999 — 40 и 2000 — 44 млн.га. В настоящее время основными трансгенными культурами являются соя, кукуруза, хлопчатник, рапс, картофель. Большая часть трансгенных сельскохозяйственных растений представлена формами, устойчивыми к гербицидам (глифосату, фосфинотрицину, иммидазолинонам) и насекомым (колорадскому жуку, кукурузному пилильщику и др.).

Генетическая трансформация древесных плодовых растений оказалась сложной задачей из-за трудностей регенерации древесных растений in vitro. Тем не менее уже имеются сообщения об успешной трансформации ряда древесных плодовых растений, включая яблоню, грецкий орех, персик, абрикос, сливу, вишню, виноград, цитрусовые, киви, пекан, папайю, кофе и некоторые другие, маркерными и несколькими потенциально полезными генами (см. обзоры Shuerman, Dandekar, 1993; Strittmatter, Wegener, 1993; Oliveira et al., 1996; Кучук, 1997; Левенко, 1998; 2000). Наиболее широко и успешно применяется Agrobacterium — опосредованный метод переноса чужеродных генов в растения. 8

Однако большинство работ по трансформации древесных косточковых плодовых культур выполнено с использованием ювенильного материала зиготиче-ского происхождения или с использованием соматических тканей подвойных форм и межвидовых гибридов, имеющих более высокий по сравнению с сортами морфогенетический потенциал. Применительно к сливе, имеются сообщения об успешной регенерации трансгенных растений после агробактериальной трансформации сегментов гипокотиля сливы маркерными генами nptll и gus (Mante et al., 1991; Scorza et al., 1994; 1995b), геном белка оболочки вируса оспы сливы (PPV) (Scorza et al., 1994) и геном белка оболочки вируса кольцевой пятнистости папайи (PRV) (Scorza et al., 1995b). Получение трансгенных сортов тормозится отсутствием надежных методик, способных обеспечить достаточно высокую частоту регенерации побегов из соматических тканей сливы домашней. В литературе имеются лишь отдельные сообщения об успешной регенерации из листовых тканей некоторых зарубежных сортов Prunus domestica (Cossio, Bassi, 1991; Yancheva, Gercheva, 1993). Решение проблемы получения трансгенных сортов сливы осложняется и тем, что антибиотики, используемые для очистки растительных тканей от Agrobacterium и как селективные маркеры, также существенным образом влияют на регенерационный процесс. Следовательно, необходима детальная работа по разработке методики регенерации целых растений из соматических тканей перспективных сортов сливы домашней.

Протокол воспроизводимой системы регенерации сливы из изолированных соматических тканей требуется для проведения исследований по различным направлениям биотехнологии, включая соматическую гибридизацию, клеточную селекцию, мутагенез in vitro, генную инженерию. Прогресс, достигнутый в этом направлении, будет способствовать применению методов биотехнологии в селекции сливы, что, в конечном счете, приведет к созданию сортов с качественно новыми признаками, которые трудно или невозможно получить методами классической селекции. 9

Источники:

http://studme.org/271477/tehnika/vspomogatelnye_metody_vitro_selektsii_rasteniy
http://medbe.ru/materials/problemy-i-metody-biotekhnologii/usloviya-i-metody-kultivirovaniya-tkaney-in-vitro/
http://www.dissercat.com/content/induktsiya-morfogeneza-v-kulture-somaticheskikh-tkanei-slivy-domashnei-prunus-domestica-l

Ссылка на основную публикацию

Adblock
detector
×
×