Колориметрический метод определения пектиновых веществ

Определение количества пектина;

Колориметрическое определение количества фруктозы

Метод основан на дегидратации моносахаридов в кислой среде с образованием из кетогексоз оксиметилфурфурола, который с раствором резорцина образует комплексное соединение вишнево-красного цвета. С альдогексозами эта реакция протекает крайне медленно и поэтому глюкоза не мешает определению.

Ход определения. Для анализа используют водную вытяжку, приготовленную для определения редуцирующих сахаров и освобожденную от белков (фильтрат А). Затем разведением доводят содержание фруктозы в испытуемом растворе до 0,01 – 0,2 мг/мл. Пипеткой отбирают 5 мл полученного разведенного раствора и переносят в мерную колбу емкостью 25 мл. Добавляют 5 мл 0,1%-ного спиртового раствора резорцина (раствор 11) и 15 мл 30%-ного раствора НСl (раствор 17), содержимое колбы перемешивают и помещают на 20 мин в водяную баню при температуре 80°С для развития окраски. Параллельно готовят холостой опыт, заменяя испытуемый раствор дистиллированной водой. Интенсивность окраски испытуемых растворов сравнивают на фотоэлектроколориметре с окраской холостого опыта и определяют оптическую плотность на светофильтре с длиной волны 540 нм.

Однако при проведении этого анализа происходит гидролиз присутствующей в растворе сахарозы и результат определения фруктозы будет завышен. Поэтому во всех случаях в той же навеске растительного материала необходимо сначала определить содержание сахарозы, а затем из полученного с резорциновым реактивом общего количества фруктозы вычесть половинное количество сахарозы, приходящееся на фруктозную часть молекулы.

Для определения содержания фруктозы строят калибровочный график по стандартному раствору фруктозы. Для этого 10 мг чистой сухой фруктозы растворяют в 100 мл насыщенного водного раствора бензойной кислоты (раствор можно длительное время хранить в холодильнике). 1 мл такого раствора содержит 1 мг фруктозы. Из этого раствора отбирают 10 мл и разбавляют водой в мерной колбе до 100 мл. Далее полученный раствор используют для построения калибровочного графика.

Контроль за содержанием пектиновых веществ в плодово-ягодном сырье, полуфабрикатах и готовой продукции очень важен. От количества и состояния пектиновых веществ зависит выход натуральных соков при производстве плодово-ягодных пастеризованных, спиртованных и сброженно-спиртованных соков. Они также являются одной из основных причин помутнения безалкогольных напитков, вин и ликеро-наливочных изделий.

Выделить пектин из растительных продуктов в природной форме не удается. При гидролизе пектиновых веществ образуется пектиновая кислота и метиловый спирт, соединенные по типу сложных эфиров с карбоксильными и спиртовыми группами галактуроновой кислоты. Поэтому все количественные методы определения пектина основаны на установлении количества пектиновой кислоты, образующейся при его гидролизе.

Ход определения. При весовом методе определения общего содержания пектина пектиновую кислоту предварительно осаждают солями кальция и в виде пектата кальция высушивают и взвешивают. Навеску тщательно измельченной средней пробы отбирают в количестве 100 г с точностью до 0,01 г в фарфоровую чашку, добавляют туда 150 мл дистиллированной воды и нагревают смесь на кипящей водяной бане не менее 1 ч. После этого теплую массу без потерь переносят через воронку в мерную колбу вместимостью 1000 мл и доливают теплой водой до метки. После охлаждения до 15°С колбу доливают холодной дистиллированной водой до метки, содержимое тщательно перемешивают и фильтруют. Фильтрат (отношение продукта к воде 1 : 10) до тех пор повторно возвращают в воронку, пока он не станет чистым. После этого в нем определяют содержание пектина.

При исследовании свежих плодов и ягод, мезги, выжимок, натуральных соков берут 10 мл фильтрата, а при анализе уваренных соков и экстрактов – 5 мл. Отобранный пипеткой фильтрат (10 или 5 мл) переносят в химический стакан вместимостью 400 мл, прибавляют 100 мл 0,1 н раствора NаOН и оставляют стоять при комнатной температуре на 5– 7 ч. Затем к раствору в стакане добавляют 50 мл 1н раствора уксусной кислоты (раствор 18а), через 5 мин 50 мл 2н раствора хлористого кальция (раствор 12) и оставляют стоять 1 ч. После чего смесь кипятят 5 мин, фильтруют через предварительно высушенный до постоянного веса и взвешенный беззольный фильтр, промывают осадок пектата кальция кипящей водой до тех пор, пока в промывной жидкости при качественной реакции с азотнокислым серебром перестанет выпадать белый осадок хлористого серебра. Осадок пектата кальция, не содержащий хлора, вместе с фильтром помещают в бюкс и сушат в сушильном шкафу при температуре 100°С до постоянного веса.

Содержание пектиновых веществ (X, %) рассчитывают по формуле:

Статья по теме: Джессика - сорт винограда

где G₂ – масса бюкса с высушенным фильтром и осадком пектата кальция, г; G₁ – масса бюкса с высушенным фильтром, г; 0,92 – коэффициент пересчета пектата кальция на пектиновую кислоту; V – объем, до которого разбавлена навеска, мл; G – навеска экстракта, г; V₁ – объем раствора, взятый для определения, мл

Вычисление производят с точностью до 0,01%. Конечным результатом считают среднее арифметическое двух параллельных определений, расхождение между которыми не должно превышать 0,05%.

Химико-аналитические методы исследования

Желирующая способность продуктов переработки плодов и овощей (джем, пастила, мармелад) главным образом зависит от содержания в них пектиновых веществ, которое устанавливают косвенным методом – определяют пектиновую кислоту, образующуюся при гидролизе. Пектиновую кислоту осаждают солями кальция и определяют весовым методом в виде соли пектиновой кислоты – пектата кальция.

Для анализа берут навеску от исследуемого продукта. Содержание пектата кальция в навеске должно быть от 0,02 до 0,05 г. Такое количество пектиновых веществ примерно содержит навеска в 2,5 г свежих плодов, соков, в 1 г моркови, в 10 г высушенных фруктовых отходов. Определенное количество исследуемого продукта экстрагируют 200 мл раствора щавелевой кислоты или щавелевокислого аммония (раствор содержит 0,5% кислоты или аммония). Экстрагирование ведут в течение 24 час, при температуре 85°. Колбу помещают на кипящую водяную баню, с таким расчетом, чтобы уровень жидкости в колбе был на 3-5 см выше кипящей поверхности в бане.

После экстрагирования жидкость отфильтровывают, а осадки промывают на фильтре жидкостью того же состава, которую применяли при экстрагировании.

Полученный фильтрат и воду после промывания переливают в колбу емкостью 250 мл и добавляют дистиллированную воду до метки. Если экстракцию проводили в щавелевокислом растворе, то перед добавлением дистиллированной воды фильтрат нейтрализуют.

Из полученной жидкости отбирают 100 мл, выпаривают до 25 мл и после охлаждения добавляют подкисленной соленой кислоты (3-5 капель) и раствор 70%-ного этилового спирта. После отстаивания в течение нескольких часов осадок отфильтровывают через складчатый бумажный фильтр, промывают подкисленным спиртом до тех пор, пока не исчезнет щавелевая кислота. Это можно проверить, если к жидкости, отобранной в пробирку до нейтрализации, добавить хлористый кальций.

Фильтр с осадком кипятят в 50 мл воды, добавляют небольшое количество аммиака. В дальнейшем фильтр с осадком измельчают и кипятят в разбавленном растворе аммиака, и смесь вновь фильтруют. Аммиачная среда способствует переходу трудно растворимой пектиновой кислоты в легко растворимую ее аммонийную соль.

Все полученные фильтраты собирают и к ним добавляют 100 мл 0,4%-ного раствора едкого натра. Жидкость отстаивают 12 час, затем осаждают, добавляя 50 мл 1 н. уксусной кислоты и 50 мл 2 н. раствора хлористого кальция. Жидкость после осаждения кипятят 5 мин. В результате реакции получают нерастворимый осадок пектата кальция. После фильтрования осадок промывают и высушивают до постоянного веса при температуре 100°.

Полученное количество пектата кальция, перечисленное в процентах к весу взятой навески и умноженное на 0,92, характеризует содержание пектина в исследуемом продукте. Коэффициент 0,92 учитывает вес пектата кальция, в котором содержится кальций, по отношению к весу пектиновых веществ.

способ определения массовой доли пектиновых веществ в растительном сырье

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к определению количества пектиновых веществ в растительном сырье. Способ предусматривает высушивание бумажных складчатых фильтров до постоянной массы, приготовление стандартизованных растворов протопектина и гидратопектина, отбор пробы. Кислую среду раствора протопектина нейтрализуют и омыляют фракции пектиновых веществ в анализируемых растворах 40%-ным раствором NaOH в течение 15 минут. После этого осаждают пектиновые вещества концентрированной HCl и фильтруют осадки. Затем осадки на фильтрах промывают холодной дистиллированной водой. Фильтры с осадками высушивают до постоянной массы и проводят расчет массовой доли фракций пектиновых веществ по определенным формулам. Изобретение позволяет повысить точность результатов определения массовой доли пектиновых веществ в растительном сырье, сократить затраты труда и времени, а также исключить использование специфического оборудования. 2 табл.

Изобретение относится к технической биохимии, а именно к определению количества пектиновых веществ в растительном сырье.

Вне зависимости от природы растительного материала и методики количественного определения содержания пектиновых веществ в нем, первым шагом всегда является приготовление «стандартизированных» растворов гидратопектина и протопектина, суть которого заключается в поэтапном и максимально полном извлечении всего гидратопектина и протопектина из растительной ткани. Полученные таким образом экстракты гидратопектина и протопектина исследуют одним из существующих способов.

Статья по теме: Сорт винограда Мираж

Известен способ количественного определения пектиновых веществ, который основан на осаждении пектиновых кислот сильными минеральными кислотами в условиях повышенного тяготения («объемный» метод).

К 200 мл «стандартизованного» раствора гидратопектина или протопектина, отобранных для исследования, прибавляют 2,5 мл 40%-ного раствора NaOH и выдерживают при комнатной температуре 15 минут. Образовавшуюся пектиновую кислоту осаждают 10 мл концентрированной HCl и центрифугируют при 3000 оборотах в минуту в течение 10-15 минут в некотором количестве градуированных центрифужных пробирок. В результате центрифугирования пектиновые коллоиды образуют осадок, объем которого измеряют в каждой пробирке. Объемы осадков во всех пробирках суммируют. Затем, пользуясь калибровочной кривой и объемом полученного осадка, определяют концентрацию пектиновых веществ [Шелухина Н.П. Научные основы технологии пектина. – Фрунзе: Илим, 1988, – 168 с.].

К недостаткам данного способа можно отнести приведенные унифицированные параметры центрифугирования, которые на практике не обеспечивают точности анализа, так как пектиновые кислоты, выделенные из различного вида сырья, обладают неодинаковой способностью к образованию осадка в условиях повышенного тяготения. В результате осадки получаются различной плотности, что неизбежно сказывается на занимаемом ими объеме, и, кроме того, часть сгустков пектиновых кислот нередко свободно размещается в объеме жидкости центрифужной пробирки, так и не перейдя в осадок. Кроме того, объем осадков в пробирках бывает настолько мал, что по градуировке пробирки точно определить его количество не удается. Все это неизбежно приводит к высокой погрешности и неточному результату анализа. К недостаткам способа также следует отнести необходимость использования специфического оборудования (центрифуга и градуированные центрифужные пробирки).

Известен способ количественного определения пектиновых веществ, который основан на осаждении пектиновых кислот в виде кальциевых солей – пектатов – и учете их количества весовым способом («кальций-пектатный» метод).

Началу проведения анализа предшествует высушивание необходимого количества бумажных складчатых фильтров при температуре 100-105°С до постоянной массы.

Раствор протопектина подготавливают к омылению, нейтрализуя кислую реакцию среды, при которой проводилось экстрагирование протопектина, гидроксидом натрия.

Далее следует стадия омыления гидратопектина или протопектина, (в зависимости от исследуемого «стандартизованного» раствора), для чего отбирают по 50 мл соответствующего «стандартизированного» раствора. В эту же колбу прибавляют такой же объем 0,1н. (0,4%) раствора NaOH. Колбу закрывают и оставляют на 8-10 часов при комнатной температуре для проведения процесса омыления карбоксильных групп пектина.

По истечении указанного времени растворы подкисляют 50 мл 1н. уксусной кислоты и выдерживают в течение 30 минут. Образовавшиеся пектиновые кислоты осаждают 50 мл 11,1% раствора CaCl₂. Полученные 1 осадки пектата кальция отфильтровывают через заранее высушенные до постоянной массы фильтры. Осадки на фильтрах промывают 0,5% раствором CaCl ₂ порциями по 50 мл, после чего осадки многократно промывают холодной дистиллированной водой для полного удаления ионов хлора. Полноту отмывки осадка пектата кальция от ионов Cl – определяют по качественной реакции фильтрата с AgNO₃ . С целью снижения зольности осадок на фильтре несколько раз промывают горячей дистиллированной водой.

Фильтры с промытым осадком аккуратно переносят в бюксы и сушат при температуре 100-105°С до постоянной массы.

Если масса осадка, полученная из разности между массой бюкса с высушенными фильтром и осадком пектина и массой бюкса с высушенным фильтром до фильтрования осадка не превышает 0,03 г, то расчет содержания отдельных фракций пектина в растительной ткани осуществляют по формуле (1):

где Х – содержание соответствующей фракции пектина в исследуемом материале, % от сырой массы;

m_ф+n – масса бюкса с фильтром и высушенным до постоянной массы осадком, г;

m_ф – масса бюкса с высушенным фильтром до фильтрования, г;

V_колбы – объем мерной колбы со «стандартизированным» раствором, мл;

0,9235 – коэффициент пересчета на пектовую кислоту;

100 – коэффициент пересчета в проценты;

m_{навески} – масса навески исследуемого материала, г;

V_экстр – объем «стандартизированного» раствора, который необходимо взять для проведения эксперимента.

Если масса осадка, полученная из разности между массой бюкса с высушенными фильтром и осадком пектина и массой бюкса с высушенным фильтром до фильтрования осадка превышает 0,03 г, то эксперимент следует повторить с меньшим количеством «стандартизированного» раствора, объем которого определяется по формуле (2):

[Методы количественного определения пектиновых веществ в растительном сырье. Методические указания к практическим занятиям / Донченко Л.В., Кондратенко В.В., Кондратенко Т.Ю. – Краснодар, 2005, – 30 с.].

Статья по теме: Зимостойкость новых сортов винограда в Запорожской области - виноград

К недостаткам описанного способа следует отнести высокую погрешность определения, равную 0,3%, что может быть связано с переходом в осадок пектата кальция непектиновых примесей, а также высокую трудоемкость и большую продолжительность процесса анализа (нередко появляется необходимость переделывать анализ по причине превышения массы пектата кальция 0,03 г).

Техническим результатом изобретения является повышение точности результатов определения массовой доли пектиновых веществ в растительном сырье, сокращение затрат труда и времени, необходимых для проведения анализов, а также исключение использования специфического оборудования.

Технический результат достигается тем, что в известном способе, включающем высушивание бумажных складчатых фильтров до постоянной массы, приготовление «стандартизованных» растворов протопектина и гидратопектина, отбор проб, нейтрализацию кислой среды раствора протопектина, омыление фракций пектиновых веществ в отобранных пробах, осаждение пектиновых веществ, фильтрование осадков, промывание осадков на фильтре дистиллированной водой, высушивание фильтров с осадками до постоянной массы, расчет массовой доли пектиновых веществ по фракциям согласно предлагаемому способу, омыление пектиновых веществ в анализируемых растворах проводят 40%-ным раствором NaOH в течение 15 минут, пектиновые вещества осаждают концентрированной HCl, а массовую долю пектиновых веществ рассчитывают по формулам (3) и (4):

где _гn – массовая доля фракции гидратопектина, %;

m₁ – масса навески исследуемого сырья, взятой для анализа, г;

m₂ – масса осадка, г;

0,8 – коэффициент пересчета объема «стандартизованного» раствора гидратопектина, взятого для исследований, к общему объему «стандартизованного» раствора гидратопектина;

100 – коэффициент пересчета в проценты;

где _nn – массовая доля фракции протопектина, %;

0,4 – коэффициент пересчета объема «стандартизованного» раствора протопектина, взятого для исследований, к общему объему «стандартизованного» раствора протопектина.

Применение 40%-ного раствора NaOH вместо 0,1н. раствора NaOH для омыления пектиновых веществ позволяет сократить требуемое для этого время с 8-10 часов до 15-ти минут.

Применение концентрированной HCl обеспечивает быструю и качественную нейтрализацию щелочной среды омыленных растворов (вместо предшествующего осаждению 11,1%-ным раствором CaCl₂, подкисления растворов 50 мл 1н. уксусной кислоты с 30-минутной экспозицией) и полное осаждение омыленных фракций пектиновых веществ, что повышает достоверность результатов определения.

Способ реализуют следующим образом. Высушивают необходимое количество бумажных складчатых фильтров до постоянной массы, готовят «стандартизованные» растворы протопектина и гидратопектина, отбирают пробы, нейтрализуют кислую среду раствора протопектина, исследуемые растворы омыляют 40%-ным раствором NaOH в течение 15 минут, затем осаждают пектиновые вещества концентрированной HCl, осадки фильтруют, промывают дистиллированной водой от ионов хлора, затем фильтры с осадками высушивают до постоянной массы, рассчитывают массовые доли фракций пектиновых веществ по формулам (3) и (4):

Примеры осуществления заявляемого способа

Пример 1. Подготавливают необходимое количество бумажных складчатых фильтров, высушивая их в бюксах в сушильном шкафу при температуре 105°С до постоянной массы.

Определения проводят в трех повторностях.

Берут навеску 10 г сухого свекловичного жома и готовят «стандартизированные» растворы гидратопектина и протопектина.

После этого из общего количества приготовленных растворов фракций пектиновых веществ отбирают пробы объемом по 200 мл и в пробе раствора протопектина нейтрализуют кислую реакцию среды титрованием 0,1н. раствором NaOH в присутствии индикатора фенолфталеина (до появления устойчивой слабо-розовой окраски).

Затем к отобранным и подготовленным для исследования пробам «стандартизованных» растворов гидратопектина и протопектина прибавляют по 2,5 мл 40%-ного раствора NaOH и выдерживают при комнатной температуре 15 минут, омыляя пектиновые вещества. При этом индикатор окрашивает растворы в насыщенный малиновый цвет.

По прошествии указанного времени образовавшуюся пектиновую кислоту осаждают 10 мл концентрированной HCl. Образовавшиеся осадки фильтруют через высушенные до постоянной массы бумажные складчатые фильтры и многократно промывают холодной дистиллированной водой для полного удаления ионов хлора. Полноту отмывки осадка от ионов хлора определяют по качественной реакции промывных вод с AgNO₃.

По окончании фильтрования фильтры с осадками аккуратно укладывают в бюксы и высушивают в сушильном шкафу при температуре 105°С до постоянной массы.

После этого определяют массу осадков, вычитая из массы высушенных фильтров с осадками массу высушенных фильтров до фильтрования, а массовую долю пектиновых веществ в исследуемом сырье определяют, используя формулы (3) и (4). Результаты расчетов заносят в таблицу 1.

1. ; .