Количественное определение кетоолигосахаридов методом хроматографии на бумаге

Количественное определение кетоолигосахаридов методом хроматографии на бумаге

ВЫДЕЛЕНИЕ КОМПЛЕКСА ПОЛИСАХАРИДОВ КАШТАНА КОНСКОГО И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА

В. А. СОБОЛЕВА, В. Н. ЧУШЕНКО, А. А. КОЛОМИЕЦ, О. С. ДАНЬКЕВИЧ, кафедра технологии лекарств, Национальный фармацевтический университет, г. Харьков

Среди разнообразных классов природных соединений все чаще внимание исследователей привлекает класс полисахаридов. Биологически активные растительные полисахариды применяются в медицинской практике для профилактики и лечения ряда заболеваний различной этиологии. Полисахариды являются потенциальными модификаторами биохимических реакций — противоопухолевыми средствами, обладают противоязвенным, обволакивающим, мягчительным и отхаркивающим действием. На их основе за рубежом и в Украине выпускается ряд полисахаридных препаратов (Плантаглюцид, Мукалтин, Крестин, Лектинан и др.) [2, 3, 7]

Продолжая изучение химического состава препаратов каштана конского [1], мы обратили внимание на то, что класс полисахаридов для данного объекта до настоящего времени почти не изучен. В связи с этим целью нашей работы является выделение полисахаридного комплекса из плодов каштана конского, разделение его на нейтральные и кислые моносахариды с количественным определением каждой группы, исследование моносахаридов хроматографическими методами для установления их качественного и количественного содержания.

Выделение полисахаридов из плодов каштана конского проводили путем экстракции измельченного сырья горячей водой (1:10), после чего полученные водные извлечения упаривали под вакуумом до 1 / 10 от первоначального объема и осаждали полисахаридный комплекс 3-х кратным количеством 95 % спирта. Количественное содержание полисахаридов определяли гравиметрическим способом после высушивания осадка [2, 7]. Результаты приведены в табл. 1.

Плоды каштана конского

Полученный комплекс полисахаридов гидролизовали 2М серной кислотой (1:50) от 30 мин до 7 ч, контролируя процесс гидролиза хроматографически. Гидролизаты нейтрализовали, осадки отфильтровывали, а из фильтратов осаждали моносахариды 95 % спиртом (1:3). После отфильтровывания кислых моносахаридов фильтраты упаривали досуха, растворяли в 70 % спирте и использовали для хроматографирования нейтральных моносахаридов.

Осадки кислых моносахаридов растворяли в теплой воде, очищали катионитом КУ-2, фильтраты упаривали досуха и тоже растворяли в 70 % спирте для хроматографирования кислых моносахаридов [2, 3, 7].

Общее содержание суммы нейтральных моносахаридов в гидролизате полисахаридов каштана конского определяли по цветной реакции с пикриновой кислотой спектральным способом в пересчете на галактозу [3, 4, 5, 7]. Результаты приведены в табл. 1.

Определение содержания суммы кислых моносахаридов (уроновых кислот) проводили по цветной реакции с карбазолом в кислой среде в пересчете на галактуроновую кислоту [2, 5, 6, 7]. Результаты приведены в табл. 1.

В результате проведенных исследований установлено, что в выделенном из каштана конского полисахаридном комплексе примерно 30 % составляет сумма нейтральных моносахаридов, а сумма уроновых кислот — около 25 %. По данным литературы значительное содержание уроновых кислот в полисахаридном комплексе обуславливает терапевтический эффект, связанный с противовоспалительной и антимикробной активностями [2, 3, 7].

Для идентификации качественного состава полученных фракций полисахаридного комплекса нами использованы методы хроматографирования на бумаге в системах растворителей: н-бутанол-пиридин-вода (6:4:3), н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5), этилацетат-уксусная кислота-муравьиная кислота-вода (18:3:1:4), а также метод ТСХ на Силуфоле в системе н-бутанол-ацетон-вода (4: 5: 1).

При сравнении с достоверными образцами стандартных моносахаридов в продуктах гидролиза полисахаридов каштана конского обнаружены нейтральные моносахариды: галактоза, глюкоза, арабиноза, ксилоза, рамноза и рибоза, а из кислых моносахаридов — галактуроновая кислота [2, 3, 5, 9].

Количественное соотношение моносахаридов в исследуемом полисахаридном комплексе определяли по методу Афанасьевой— Зайцевой по реакции с анилинфталатным реактивом спектральным методом после разделения моносахаридов методом хроматографии в тонком слое сорбента на Силуфоле [3, 6, 8]. Результаты исследования представлены в табл.2.

Справочник химика 21

Химия и химическая технология

Определение углеводов методом хроматографии иа бумаге

Количественное определение углеводов методом нисходящей хроматографии на бумаге (по Г. Н. Зайцевой и Т. П. Афанасьевой). [c.157]

Все методы анализа сырья с целью установления состава, строения и свойств полисахаридов основаны на определении отдельных компонентов, содержащихся в гидролизатах полисахаридов, полученных при различных условиях гидролиза. Наиболее полную информацию о составе моносахаридов, олигосахаридов и уроновых кислот, присутствующих в гидролизатах, получают тогда, когда делают анализ хроматографическим методом на бумаге. Этим методом сахара и другие вещества разделяют и выделяют из смеси с различными веществами в том виде в каком они присутствуют в гидролизатах без изменений, а затем определяют их количество. При анализе смесей углеводов ч помощью газожидкостной хроматографии сахара необходимо сначала превратить в летучие производные, а затем провести их разделение и определение. Без потерь перевести сахара в летучие производные невозможно, поэтому результаты анализов менее точны, но время, затрачиваемое на анализ этим методом, значительно меньше [14]. [c.24]

Метод хроматографии на бумаге щироко применяется для определения неорганических соединений, аминокислот, аминов, белков, углеводов, жирных кислот, фенолов, витаминов в химической, пищевой, фармацевтической промышленности, медицине, биохимии. [c.364]

Лауриновую, миристиновую, пальмитиновую и стеариновую кислоты, каждая в количестве 40 мкг, разделяли методом хроматографии на бумаге с обращенными фазами. Для разделения использовали бумагу, пропитанную смесью низкомолекулярных углеводо-дов точность определения от —1,3 до +1,4% [119]. В этом методе [c.163]

Хроматография на бумаге при изучении антибиотиков очень часто применяется на ранних этапах исследования, когда отсутствуют данные о химической природе изучаемого вещества. Поэтому при использовании этого метода возникает много вопросов, которые обычно не встают перед исследователем при изучении определенных групп природных веществ, например белков, углеводов, стероидов и т. д. К числу таких вопросов относится классифицирование антибиотиков методом так называемых сборных хроматограмм , изучение однородности антибиотиков с использованием самых различных методов обнаружения их на хроматограммах и т. п. [c.21]

Дальнейших успехов в химии гликонротеинов следовало ожидать на основе развития методов и лабораторной техники идентификации и количественного определения малых количеств сахаров и аминокислот, структурного анализа олиго- и полисахаридов, эффективного разделения и очистки белков, оценки гомогенности макромолекул и определения их молекулярных весов. С введением улучшенных методов исчерпывающего метилирования и периодатного окисления углеводов, реагентов (борогндридов щелочных металлов), избирательно восстанавливающих карбонильную группу, аналитической ультрацентрифуги Сведберга, аппарата Тизелиуса для электрофореза с подвижной границей, ультрафиолетовой и инфракрасной спектроскопии, метода меченых атомов, метода фракционирования белков плазмы крови холодным спиртом по Кону, хроматографии на бумаге и на колонках, хроматографии на ионообменниках, полученных из целлюлозы, упрощенных микрометодов электрофореза (электрофорез на бумаге, крахмальном или агаровом гелях), иммуноэлектрофореза и, наконец, последнего по времени, но важного в этой области открытия конститутивных и индуцируемых бактериальных ферментов, действующих избирательно на гетеросахариды, настало время для третьего и наиболее сложного и плодотворного периода исследования гликонротеинов. [c.18]

Лауриновую, миристиновую, пальмитиновую и стеариновую кислоты, каждая в количестве 40 мкг, разделяли методом хроматографии на бумаге с обращенными фазами. Для разделения использовали бумагу, пропитанную смесью низкомолекулярных углеводо-дов точность определения от —1,3 до +1,4%) [119]. В этом методе ориентационную, калибровочную и основную хроматограммы проявляли и высушивали одновременно. После кондиционирования аммиаком в течение 6—8 ч ориентационную (калибровочную) хроматограмму погружали в 0,03%-ный водный раствор нерадиоактивного Со(ОАс)2 и проявляли хорошо разделенные пятна 1%-ным раствором сульфида аммония. Остальные хроматограммы после кондиционирования аммиаком разрезали на кусочки размером 3 см. Те кусочки, которые содержали часть идентифицированных одиночных пятен, погружали в раствор меченого реагента и промывали, в результате чего образовывался Со5. После этого определяли полную радиоактивность °Со5, полученного из каждой кислоты. Содержание каждой кислоты в пробе вычисляли по полной радиоактивности соответствующих пятен основной и калибровочной хроматограмм, принимая во внимание, что полная радиоактивность пропорциональна количеству данной кислоты в пробе. Во избежание ошибок необходимо строго контролировать величину pH раствора. При pH 6,0 на бумаге адсорбируются трудно десорбируемые ионы кобальта. [c.163]

Хроматографию на бумаге в сочетании с применением органических реактивов широко используют для разделения близких по свойствам соединений аминокислот, пептидов, нуклеиновых кислот, углеводов. Кроме того, ее применяют для определения следов хлорорганических, фосфорорганических и других пестицидов в пищевых продуктах и в биологическом материале. Этим методом также разделяют пигменты листьев. [c.460]

Для количественного определения углеводов, разделенных хроматографией на бумаге, используют различные методы. Количество моносахарида можно определить непосредственно на хроматограммах измерением денситометром [53] интенсивности окраски пятен, полученных при проявлении, например, анилинфталатом [54] или азотнокислым серебром [55]. Ошибка прямого измерения интенсивности окраски пятен достигает Ю—15%, поскольку окраска часто бывает нестабильной и в сильной степени зависит от условий обработки хроматограмм перед измерением. Однако из-за быстроты определения этот метод находит применение. [c.76]

Количественное определение сахаров на хроматограмме можно провести методом денситометрии. Так, например, описан способ оценки содержания сахаров в клинических анализах крови и мочи при концентрациях до 10 мкг/мл с точностью 2—3,5% [394]. При препаративной хроматографии на бумаге зоны, соответствующие разделяемым соединениям, вырезают и элюируют водой или 50%-ным этанолом. В результаты любых определений углеводов, выделенных таким образом, следует вносить поправку на присутствие следов целлюлозного материала из бумаги, количество которого можно оценить после элюирования в тех же условиях пустого образца бумаги тех же размеров, что и хроматографическая зона. [c.62]

Для идентификации сиаловых кислот применяется хроматография на бумаге в тонком слое силикагеля или электрофорез на бумаге Если хроматографические данные показывают, что новая сиаловая кислота отличается от всех других известных сиаловых кислот, ее выделяют и очищают методами, принятыми в химии углеводов, учитывая при этом особую неустойчивость сиаловых кислот по сравнению с другими моноса- харидами, а затем проводят функциональный анализ (в первую очередь, определение метоксильных, Н- и О-ацетильных групп). Положение заместителей в молекуле определяют обычными методами, прежде всего окислением перйодатом. [c.338]

Эти методы применяют для быстрой и селективной идентификации аскорбиновой кислоты в смеси витаминов. Количественное определение, как и в случае хроматографии на бумаге [34], следует проводить титрометрически или фотометрически после локализации пятна (непосредственной или с использованием метода направляЬзщей полосы), соскабливания и элюирования. Таким способом Штрогеккер [55] определил аскорбиновую кислоту в продуктах питания в смеси с растворимыми углеводами, соскабливая окрашенные в кирпично-красный цвет пятна динитрофенилгидразона аскорбиновой кислоты, элюируя 85 %-ным раствором серной кислоты, фильтруя и фото-метрируя. [c.247]

Смотреть страницы где упоминается термин Определение углеводов методом хроматографии иа бумаге: [c.438] [c.342] [c.343] [c.247] [c.18] Методы биохимии растительных продуктов (1978) — [ c.0 ]

Количественное определение кетоолигосахаридов методом хроматографии на бумаге

Лабораторная работа № 39

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ УГЛЕВОДОВ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Цель работы: ознакомиться с методом тонкослойной хроматографии углеводов.

Принцип метода. При проведении хроматографического разде­ления углеводов методом тонкослойной хроматографии пластинку с тонким слоем пористого носителя (например, пластинку SiluFol), на которую нанесены растворы углеводов, помещают в растворитель, который, продвигаясь за счет капиллярных сил, перемещает углевод. По завершению хроматографии проводят об­работку пластинки, позволяющую выявить пятна углевода, и рас­четным методом определяют массу углевода в исследуемом растворе.

Оборудование и реактивы: пластинки Silufol или SilufoI–UV, исследуемый (раствор меда) и стандартный (10 мкг в пробе) раствор углевода (глюкозы, галактозы, фруктозы, сахарозы, мальтозы), растворитель — смесь бутанол-ацетон-вода (4:5:1), в случае использования пластинок Silufol нафторезорциновый реактив (свежеприготовленная смесь равных объемов 20 %-го водного раствора трихлоруксусной кислоты и 0,2 %-го спиртового раствора нафторезорцина). Микропипетки, пульверизатор в случае использования пластинок SilufoI или источник ультрафиолетового света в случае использования пластинок Silufol–UV, хроматографическая камера, линейка, простой карандаш, планиметр, сушильный шкаф.

Ход работы

Ha пластинке на расстоянии2 смот нижнего края (линия старта) аккуратно намечают карандашом три точки нанесения растворов углеводов. C помощью микропипетки в отмеченные места наносят равные объемы исследуемого раствора углевода (5 – 20 мкг в пробе), разбавленного исследуемого раствора углевода и стандартного раствора углевода таким образом, чтобы получить пятна одного диаметра. После высушивания пятен пластинку помещают в хроматографическую камеру, на дне которой находится растворитель — смесь бутанол-ацетон- вода (4 :5:1). Высота слоя растворителя —1 см. Хроматографию проводят до прохождения растворителем10 смот линии старта. После этого хроматограмму высушивают и проявляют. При использовании пластинок Silufol хроматограмму опрыскивают из пульверизатора раствором нафторезорцина и сушат в сушильном шкафу 5 – 10 мин при температуре 90 – 100 ºС для проявления пятен углевода. Пятна глюкозы и галактозы имеют сине–фиолетовый цвет, фруктозы — красно–черный, сахарозы и мальтозы — красный, лактозы — красно–фиолетовый, рамнозы — зеленый, ксилозы — светло–серый, манозы — светло–синий, арабинозы — сине–зеленый.

B случае использования пластинок Silufol–UV пятна углевода выявляют под ультрафиолетовым светом.

Определяют площадь пятен. Массу углевода в пробе исследуемого раствора (мкг) рассчитывают по формуле

,

где М_st – масса углевода в пробе стандартного раствора;

S_st, S, Sp – площади пятна стандарта; исследуемого раствора и разбавленного исследуемого раствора;

P – фактор разведения.

Оформление работы

Привести расчеты по приготовлению реактивов. Провести ТСХ углеводов, идентифицировать их и определить содержание в пробе.

Источники:

http://provisor.com.ua/archive/2009/N16/kahkon_169.php
http://www.chem21.info/info/219551/
http://ebooks.grsu.by/lab_pr_bio/laboratornaya-rabota-39-opredelenie-soderzhaniya-uglevodov-metodom-tonkoslojnoj-khromatografii.htm