Классификация пектолитических ферментов — Превращения в винограде

Введение

Пектолитические ферменты широко используются в различных областях. Процесс гидролиза пектиновых веществ имеет большое значение для переработки плодов, ягод и овощей. Использование пектолитических ферментов позволяет резко повысить сокоотделение (на 5-25 %) при производстве осветленных соков, особенно из тех плодов и ягод, которые не имеют собственных пектолитических ферментов и содержат повышенные количества пектина (слива, алыча, абрикосы, персики, груши и др.). При изготовлении фруктово-ягодных напитков с мякотью ферменты позволяют снять нежелательный желирующий эффект.

Наиболее важными источниками пектолитических ферментов являются микроскопические грибы, особенно различные виды рода Aspergillus: A. awamori, A. foetidus, A. niger, A. terreus и др. Среди бактерий найдены активные продуценты пектиназ, относящиеся к роду Clostridium; среди дрожжей культура Saccharomyces fragilis образует пектолитические ферменты.

Свойства пектолитических ферментов

Условно все пектолитические ферменты (пектиназы) можно разделить на пектолитические ферменты, гидролизующие пектиновые вещества с участием воды (гидролазы), и негидролитические ферменты, осуществляющие расщепление пектиновых веществ с образованием двойной связи в продуктах расщепления (лиазы — пектинтрансэлиминазы).

К гидролазам относятся пектинэстераза (ПЭ) и полигалактуроназы (ПГ). пектолитический фермент пектиназа аэробный

Пектилгидролаза пектинов (КФ 3.1.1.11) представляет собой гидролазу эфиров карбоновых кислот. Микробная ПЭ имеет оптимальный рН от 4,5 до 5,5. Ионы Са и Mg активируют ПЭ. Фермент расщепляет сложноэфирные связи, причем только в том случае, когда в непосредственной близости к омыляемой связи находится СООН-группа (рис.1).

Рис. 1 Схема действия пектинэстеразы

Наибольшее сродство ПЭ проявляет к метильному остатку в 5-м положении (I), т. к. в положениях 4 и 6 имеются свободные СООН-группы. Омыление эфирной связи в положениях 3 и 7 происходит во вторую очередь (II). В результате действия ПЭ накапливаются частично или полностью деметоксилированная полигалактуроновая кислота и метанол.

Полигалактуроназа (ПГ), или полигалактуронидгликаногидролаза (КФ 3.2.1.15), осуществляет гидролитическое расщепление б -1,4-гликозидных связей в пектиновых веществах. ПГ является многокомпонентной системой и проявляет большую специфичность к субстрату. По субстратной специфичности ферментов различают следующие типы полигалактуроназ.

  • · Полиметилгалактуроназы (ПМГ) — ферменты, действующие на метоксилированную полигалактуроновую кислоту (пектин); ПМГ представлены двумя типами: эндо-ПМГ-I и экзо-ПМГ-III.
  • · Эндо-ПМГ-I является разжижающим ферментом, гидролизующим нативный этерифицированный пектин тем быстрее и эффективнее, чем выше степень его этерификации. Присутствие ПЭ в растворе снижает активность эндо-ПМГ-I. Этот тип фермента широко распространен среди грибов (A. niger, Botrytiscinerea, Neurosporacrassa, A. awamori и др.).
  • · Экзо-ПМГ-III является осахаривающим ферментом концевого действия, отщепляющим по одному остатку галактуроновой кислоты от пектиновой кислоты или пектина. Фермент проявляет сродство к метоксилированному остатку элементарного звена, гидролизуя концевую б-1,4-связь между двумя остатками галактуроновых кислот, имеющих СООСН3-группы.
  • · Полигалактуроназы (ПГ) — ферменты, действующие на пектовую или пектиновую кислоту; они также разделены на два типа: эндо-ПГ-II и экзо-ПГ-IV.
  • · Эндо-ПГ-II — разжижающая ПГ, которая гидролизует пектиновую или пектовую кислоту. Она действует только при наличии в звеньях свободных СООН-групп. Активность эндо-ПГ-II значительно возрастает в присутствии ПЭ. Фермент синтезируется грибами и бактериями.
  • · Экзо-ПГ-IV проявляет сродство к концевой гликозидной связи, которая не примыкает к этерифицированному звену.
Статья по теме:   Як захистити виноград від шкідників та хвороб

Пектинтрансэлиминазы осуществляют негидролитическое расщепление пектиновых веществ с образованием двойной связи в галактуроновом остатке между 4 и 5 углеродными атомами (рис.2).

Рис. 2 Схема действия пектинтрансэлиминаз

Пектинтрансэлиминазы действуют как на пектин, так и на пектовые кислоты. В номенклатуру ферментов вошли два фермента этой группы:

  • · экзополигалактуронатлиаза — поли(1,4-б-D-галактуронид)экзолиаза (КФ 4.2.2.9) — фермент элиминирует д-4,5-D-галактуронозо-D-галактуронатные остатки с редуцирующего конца деэтерифицированного пектина;
  • · пектинлиаза — поли(метоксигалактуронид)лиаза (КФ 4.2.2.10) — фермент деполимеризует пектин путем элиминирования остатков 6-метил-Д-4,5-D-галактуроната; не действует на деэтерифицированный пектин.

Таким образом, первый фермент проявляет сродство к неметоксилированным, а второй — к метоксилированным звеньям.

Извлечение сока из плодов

Отдача сока плодовой мезгой находится в определенной зависимости от количества и состояния пектиновых веществ в сырье. Плоды, содержащие пектиновые вещества преимущественно в виде нерастворимого протопектина (яблоки), и плоды, содержащие мало пектина (вишни), легко отдают сок. Из плодов, богатых пектином, образующим вязкий коллоидный раствор, например из черной смородины, сок извлекается с трудом. Отдача сока облегчается, если мезгу выдержать несколько часов. При этом под воздействием фермента пектазы (пектинэстеразы), содержащегося в плодах, происходит гидролитическое отщепление метоксильных групп от растворимого пектина; в результате образуется практически нерастворимая пектиновая (полигалактуроновая) кислота и метиловый спирт:

При гидролизе пектина вязкость сока уменьшается и соответственно увеличивается сокоотдача. В зависимости от количества пектина и активности пектазы мезга выдерживается различное время. При 20-25° С достаточна выдержка для малины в течение 4 ч, для черной смородины б — 8 ч, для абрикосов и кизила 10-12 ч. Выход сока из выдержанной мезги увеличивается по сравнению с невыдержанной от 4 до 25% в зависимости от вида плодов.

Для повышения выхода и получения прозрачного сока, не содержащего пектина, в мезгу или непосредственно в плоды перед их дроблением добавляют пектолитический ферментный препарат, обладающий высокой пектиназной и пектазной активностью. При совместном действии этих ферментов разрушается коллоидная структура пектина и образуется водорастворимая моногалактуроновая кислота.

Пектолитический ферментный препарат получают из плесневого гриба Aspergillus niger, выращенного на среде, состоящей из пшеничных отрубей, яблочных и морковных выжимок. Среда, проросшая мицелием гриба, высушивается и измельчается до порошкообразного состояния. Сухой пектолитический препарат обладает пектолитической активностью в 42 единицы. Для обработки мезги препарат применяется в виде порошка либо он растворяется в соковой вытяжке того плода, который подвергается обработке. В последнем случае сухой препарат настаивается в соке при соотношении 1:10 и температуре 40° С в течение 3 ч.

Известно несколько вариантов обработки мезги пектолитическимн ферментами. Если требуется только повысить выход сока, мезга ферментируется при 43-45° С в течение 4 — 8 ч при дозе препарата от 0,5 до 2,0% к массе мезги в зависимости от вида плодов. При данном режиме не достигается полного гидролиза пектиновых веществ, однако вязкость сока значительно снижается. Если, кроме высокого выхода, требуется получить сок с гидролизованным пектином, не требующий последующего осветления, ферментация мезги производится при такой же температуре 43 — 45° С, но с большими дозами ферментного препарата и более продолжительное время. В зависимости от вида плодов продолжительность ферментации мезги и дозы ферментного препарата приведены в табл. 7.

Статья по теме:   Пола - виноград

Таблица 7. Продолжительность ферментации и доза препарата.

Ферменты в вине

Классификация ферментов, содержащихся в вине.

По международной классификацией ферменты делятся на шесть классов:

Класс 1. Оксидоредуктазы (окислительно-восстановительные ферменты).

Этот класс ферментов катализирует перенесение атомов водорода и электронов (оксидазы, дегидрогеназы, пероксидазы, каталазы), а также присоединение кислорода к окисляемому субстрату.

Класс 2. Трансферазы (ферменты переноса), катализирующие перенесение

Целых атомных группирований (остатков фосфорной кислоты, остатков моносахаридов и аминокислот, аминных или метильных групп) от одного соединения к другому.

Класс 3. Гидролазы, катализирующие при участии воды расщепления (гид-

Ролиз) разных сложных органических соединений на более простые.

Класс 4. Лиазы, катализирующие реакции негидролитического отщепления

Разных групп от субстратов с образованием двойной связи или наоборот, соединение групп с двойными связями.

Класс 5. Изомеразы (ферменты изомеризации), катализирующие преобразо-

Вание органических соединений в их изомеры (химические соединения, одинаковые по составу и молекулярной массе, но различные по строению и свойствам).

Класс 6. Лигазы (синтетази), они катализируют соединения двух молекул

Вместе с расщеплением пирофосфатной связи в молекуле АТФ.

Все классы ферментов разделяются на подклассы, а подклассы в свою очередь на подподклассы.

Итак, в четырехзначном шифре, принятом для обозначения ферментов, первое число обозначает класс, второе – подкласс, третье – подподкласс и четвертое – конкретный фермент. В целом шифр фермента – это положение фермента в номенклатуре и обозначение характера катализируемой реакции.

В зависимости от природы самого фермента, он имеет разный механизм и химизм действия на органические вещества и соединения. Он характеризуется энергией активации биохимической реакции вследствие поляризации, смещения электронов и деформации связей, привлеченных в реакцию.

Действие каждого фермента строго ограничено одной реакцией и одним веществом (или очень небольшим количеством близких по составу веществ, имеющих одинаковое химическое группирование: сложноэфирное, альдегидное или другое).

В связи с тем, что ферменты являются естественными катализаторами белкового происхождения, при высоких температурах происходит их денатурация. Кроме того, из водных растворов они осаждаются спиртом, ацетоном и другими органическими растворителями, а также насыщенными растворами солей.

В большинстве случаев при проведении ферментативной реакции в виноделии, кроме субстрата и фермента, необходимо присутствие кофакторов, т. е. сложных органических соединений, принимающих непосредственное участие в процессах ферментации. К таким кофакторам (активаторам) относятся витамины и их производные, цитохромы, неорганические ионы (Na, K, Mg, Ca, Zn, Fe, Co, Ni, Al, Cu, и другие). Кофакторы действуют непосредственно на фермент и приводят его к активному состоянию.

Молекулярная масса ферментов находится в пределах 10000. 1000000.

Биосинтез ферментов (образование сложных органических веществ из более простых соединений, протекающих в живых организмах или извне под действием биокатализаторов-ферментов), в клетке происходит постоянно и регулируется так, что их образуется столько, сколько необходимо для обеспечения метаболизма клетки. В самой клетке выключается синтез ферментов, лишних в данный момент, а фонд аминокислот (производных белка) используется для синтеза других ферментов, необходимых в этот момент клетке.

В живой клетке действие ферментов регулируется не только путем индукции или репрессии, или специфическими активаторами и ингибиторами, но и путем связывания их разными структурами протоплазмы. Так, например, связывание фермента с белками обуславливает потерю их ферментативной активности, освобождение фермента от белка повышает его активность.

Статья по теме:   Великие виноградные лозы

Активность ферментов очень зависит от температуры среды. Для большинства ферментов оптимальная температура находится в пределах 40. 45 оС. Как правило, каталитическая активность ферментов проявляется в небольшом диапазоне рН. Оптимум рН для большинства ферментов находится в пределах 5. 9, но для пепсина 1,5.

Установлено, что некоторые вещества способны ингибировать (угнетать) каталитическое действие ферментов. К ним относятся такие белки-осадители, как соли свинца, ртути, вольфрама, а также танин и трихлоруксусная кислота. Они действуют на все ферменты.

В винограде, дрожжах и молодом вине встречаются представители всех шести классов ферментов. Однако наиболее изучены из них представители 1-го и 3-го классов: оксидоредуктазы и гидролазы. Эти ферменты продуцирует виноградное растение, и они активно действуют при переработке винограда и при получении вина. Кроме того, на поверхности виноградных ягод в отдельные годы развивается некоторые плесневые грибы, в частности Biotrytis cinerea. Эти грибы вырабатывают группу ферментов, переходящую в сусло и вино.

Окислительные ферменты плесневых грибов значительно сильнее, чем ферменты виноградной ягоды. Это может привести к возникновению порока вина бурого (оксидазного) касса, при котором фенольные вещества жидкости окисляются буквально на глазах с последующим покоричневением и выпадением в осадок. В винограде имеют место также пектолитические и цитолитические (разрушающие стенки клеток ягод) ферменты.

Локализованы ферменты в разных частях виноградной ягоды неодинаково. Наибольшая активность ферментов сосредоточена в кожице и мякоти. В начале созревания винограда большинство ферментов содержится в мякоти, а в период технической зрелости − в кожице. В сусле-самотеке активность ферментов ниже, чем в первой и второй прессовых фракциях. Значительно снижает активность ферментов сульфитация сусла. Активность ферментов также снижается при обработке сусла бентонитом. Причиной такого явления является сорбция бентонитом белков.

При спиртовом брожении виноградного сусла активность ферментов винограда резко снижается. Если вино некоторое время было выдержанно на дрожжах, в него переходят, в основном, ферменты дрожжей, в том числе оксидоредуктазы. При обработке молодого вина бентонитом, танином, а также при продолжительной выдержке вина, активность оксидоредуктаз снижается к нулю.

Особенное внимание в виноделии заслуживают пектолитические ферменты, расщепляющие пектиновые вещества. В число пектолитических ферментов входит протопектиназа, действующая на протопектин с образованием растворимого пектина, а также арабана и галактана. В результате действия протопектиназы, которая более активная, к окончанию созревания винограда, ягоды, как и плоды других растений, размягчаются, так как при этом распадается протопектин.

Сернистая кислота в оптимальных дозах (до 150. 200 мг/дм3) не снижает активности пектолитических ферментов. Угнетающе действие на пектолитические ферменты оказывают фенольные соединения винограда, а потому в сусле из винограда красных сортов активность их ниже, чем из белых. В красных винах пектиновых веществ намного больше, чем в белых. Оптимальной температурой активного действия пектолитических ферментов является 35. 45 оС, а потому подогрев сусла или мезги до этой температуры усиливает эффект действия этих ферментов. При брожении сусла пектолитические ферменты винограда снижают свою активность и постепенно инактивируются.

Источники:

http://studwood.ru/1602352/tovarovedenie/svoystva_pektoliticheskih_fermentov
http://www.comodity.ru/nonsoftalco/juice/35.html
http://vinograd-vino.ru/sostav-vinograda-i-vina/224-fermenty-v-vine.html

Ссылка на основную публикацию

Adblock
detector
×
×