Индукция сомаклонов вишни in vitro

Способ размножения вишни in viтrо

Авторы патента

Иллюстрации 2

Категории

Патент 1639534

Способ размножения вишни in viтrо

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при клональном микроразмножении косточковых культур. Целью изобретения является увеличение выхода растений-регенерантов, увеличение укореняемости и улучшение приживаемости при пересадке растенийрегенерантов в нестерильные условия. Поставленная цель достигается тем, что перед вычленением апикальной меристемы с побегов маточного растения его обрабатывают в период интенсивного роста водным раствором тидиазурон -М-фенил-М(1,2,3-тиадиазолил-5)мочевины в концентрации 0,0001-0,0025% по д.в., причем вычленения апикальной меристемы осуществляют в весенний период в течение последующих двух лет. После этого меристемы культивируют на питательной среде до получения растений-регенерантов . Способ позволяет более чем в 2 раза увеличить выход растений регенерантов увеличить укореняемость до 50% и приживаемость в нестерильных условиях до 60-90% растений-регенерантов. 1 табл. ел

„., Я3 1639534 А1 (я)ю А 01 Н 4/00

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР,(гг ), 8″- . —ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 ные почки с участком стебля. В качестве эксплантата используют верхушечные меристемы с двумя-тремя примордиальными листьями (300 — 400 мкм). о

Все операции, связанные со стерилизацией растительного материала, вычленением эксплантатов, приготовлением питательных сред, культивированием эксплантатов, проводят flo известному способу.

– При культивировании эксплантатов вишни на этапе введения в культуру и укоренения используют модифицированнуЮ среду Мурасиге-Скуга, на этапе размножения — среду Готре, Уайта. Условия выращивания 16 ч, 3-5 тыс.люкс., 22 — 26 С, (21) 4682076/13 (22) 19,04,89 (46) 07,04.91, Бюл. № 13 (71) Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева (72) И.В. Агафонов, А,Г. Матушкин, И.B. Жаркова, В.B. Фаустов и О,Н. Аладина (53) 581.143.6(088.8) (56) Попов Ю.Г. и др. Культура стеблевых верхушек in vItro, как метод ускоренного размножения плодовых и ягодных растений. — Вестник с/х науки, 1978, ¹ 3. (54) СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ ВИШНИ IN I/lTR0 (57) Изобретение относится к биотехнологии и мажет быть использовано при клональном микроразмножении косточковых культур. Целью изобретения является увеличение выхода растений-регенерантов, Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при клональном микроразмножении косточковых культур.

Целью изобретения является увеличение выхода растений-регенерантов, увеличение укореняемости и улучшение приживаемости при пересадке растенийрегенерантов в нестерильные условия.

Пример, В период активного роста побегов проводят обработку маточных растений вишни (сорт Апухтинская) водным раствором тидиазурон-N-фенил(1,2,3-тиадиаэолил-5)мочевиной (дроппом) в концентрации. 0,0001, 0,0013, 0,0025 $, по д.в, Весной следующего года с обработанных деревьев заготавливают верхние части побегов, длиной до 1 см и боковые вегетативувеличение укореняемости и улучшение приживаемости при пересадке растенийрегенерантов в нестерильные условия. Поставленная цель достигается тем, что перед вычленением апикальной меристемы с побегов маточного растения его обрабатывают в период интенсивного роста водным раствором тидиазурон -N-фенил-N(1,2,3-тиадиазолил-5)мочевины в концентрации

0,0001 — 0,0025 $ по д.a., причем вычленения апикальной меристемы осуществляют в весенний период в течение последующих двух лет. После этого меристемы культивируют на питательной среде до получения растений-регенерантов. Способ позволяет более чем в 2 раза увеличить выход растений регенерантов, увеличить укореняемость до 507ь и приживаемость в нестерильных условиях до 60 — 90% растений-регенерантов, 1 табл.

Использование в технологии микроразмножения обработки маточных растений вишни трудноразмножаемых сортов физиологически активным веществом (дропп) Индукция пролифераии, шт.

Концентрация дроппа О

Укоренение микропобегов, Приживаемость в нестеильных словиях, Действие в

Последейст- Дествие в 1 вие на 2-й го год

Последействие на 2-й год

Последействие на 2-й го

Контроль (известный способ)

Редактор H.Ðîãóëè÷ Техред М,Моргентал Корректор А.Осауленко

Заказ 971 Тираж 362 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат “Патент”, г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

В качестве обьекта выбран сорт Апухтинская с низкой эффективностью размножения.

Данные влияния предварительной обработки маточного растения водным раствором дроппа в период интенсивного роста представлены в табл.

Вычленение меристематических верхушек проводилось весной следующего года после обработки маточных растений регулятором и через год, Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о заметном влиянии предварительной обработки маточника дроп пом (0,0001 — 0,025 ) на пролиферацию пазушных почек на среде размножения с более высокой, чем по известному способу укореняемостью микропобегов, и, что особенно важно в микроразмножении косточковых, до 85-90 возрастает приживаемость растений при пересадке в нестерильные условия, Гибель таких растений по известному способу составляет 50 — 90 . обеспечивает надежный выход пробирочных растений, стимулируя пролиферацию пазушных почек, увеличивая укореняемость микропобегов, упрощает этап укоренения и, 5 что особенно важно, обеспечивает высокую приживаемость при пересадке микрорастений в нестерильные условия. Эффект обработки сохраняется на следующий год:

10 Способ размножения вишни in vitro, включающий вычленение апикальной меристемы с побегов маточного растения и последующее культивирование меристемы на питательной среде с регуляторами роста до

15 получения растений-регенерантов, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью увеличения выхода растений-регенерантов, увеличения укореняемости и улучшения приживаемости при пересадке растений-регенерантов в

20 нестерильные условия, маточные растения перед вычленением апикальной меристемы обрабатывают в период интенсивного роста водным раствором тидиазурон-N-фенилN(1 2,3-тиадиазолил-5) мочевины в концент25 рации 0,0001 — 0,0025 по д,в., причем вычленение апикальной меристемы осуществляют в весенний период в течение последующих двух лет.

Условия и методы культивирования тканей in vitro

Любая ткань растений – это сообщество клеток, и если она изолирована (выделена) из целого организма, то лишена его регулирующего воздействия и питания. Следовательно, одним из принципов метода культуры тканей (клеток) является воспроизведение in vitro условий, близких или идентичных тем, в которых клетки находятся на материнском растении, для обеспечения их полноценного питания и развития.

Тогда при строгом соблюдении этих условий в культуре тканей размножаются (регенерируют) идентичные исходному генотипу клетки и растения. Это одно из направлений использования. Однако если такие условия достигаются и воспроизводятся не в полной мере, то клетка оказывается в относительно иных физико-химических условиях, что приводит к временному и качественному изменению в реализации ее генетической информации.

Смещая в эксперименте временную реализацию генетической информации (с помощью гормональных воздействий), можно наблюдать ее модификацию, а под влиянием различных экстремальных трансформирующих факторов возможно ее изменение в нужном направлении. Клетка в условиях культуры in vitro проявляет цитогенетическую неустойчивость, в результате этого возникают клетки с генетической гетерогенностью, появляются мутанты с измененным морфогенезом, которые могут быть исходным материалом для селекции.

Состав питательных сред и роль их отдельных компонентов

Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям неорганические элементы: макроэлементы в миллимолярных концентрациях (азот, фосфор, калий, кальций, магний, сера), микроэлементы – в микромолярных (железо, бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.), а также органические элементы: витамины, углеводы, аминокислоты и другие (например, гидролизат казеина, мезоинозит и др.).

В зависимости от консистенции существует деление на жидкие и твердые питательные среды.

Для приготовления твердых питательные сред используют агар-агар (0,7-1 %), который представляет собой полисахарид, получаемый из морских водорослей. Обычная его концентрация – 8-10 г на литр среды. Агар обеспечивает диффузию питательных элементов из среды в культивируемые ткани. Вместо агара можно использовать биогели.

Необходимо учитывать, что клетки растений и отдельные компоненты среды (витамины, фитогормоны, агар) чувствительны к определенным концентрациям водородных ионов. Например, агар в кислой среде теряет способность образовывать гель. В зависимости от объектов культивирования рН среды может варьировать от 5,2 до 6,6.

Неорганические элементы. Для роста растений в первую очередь необходимы углерод, кислород и водород. Если кислород и водород присутствуют в воздухе, то источником углерода для культуры изолированных тканей являются органические соединения. Но кроме этого для обеспечения полноценного метаболизма и его регуляции в изолированной культуре необходим ряд макро- и микроэлементов неорганического происхождения.

Макроэлементы присутствуют в среде в концентрациях порядка 10 М. Наиболее значимы из них азот, фосфор, натрий, калий, магний, кальций и сера.

Микроэлементы составляют в среде концентрации 10-6 М. Присутствие их обязательно при культивировании ткани в жидкой среде. По некоторым данным, отсутствие микроэлементов уменьшает интенсивность роста на 40 % в первом пассаже и приводит культуру к гибели в течение двух следующих пересадок. На агаризованой среде растения не так остро реагируют на отсутствие микроэлементов, так как в агаре содержатся многие микро- и некоторые макроэлементы.

Наиболее важными микроэлементами являются железо и медь, потому что они участвуют в регуляторных процессах и окислительно-восстановительных превращениях, входят в состав важных коферментов. Далее следуют марганец, цинк, молибден, кобальт и бор.

Органические составляющие сред. Согласно многочисленным данным, хорошим источником азота является мочевина, особенно для тканей подсолнечника, табака, топинамбура и др.

В качестве дополнительного источника азота в состав сред добавляют аминокислоты (а-аланин, глутаминовую кислоту, глицин, аргинин, аспарагиновую кислоту) или гидролизат казеина – источник аминокислот.

В культуре изолированных тканей растений действие аминокислот значительно варьирует для разных тканей и разных физиологических состояний вводимых в культуру эксплантов. Полностью заменить нитраты как источник азота способны аланин, аргинин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты, гликокол, аспарагин, пролин.

Формы аминокислот также по-разному влияют на рост: D-формы -токсичны, L-формы – пригодны. Аминокислоты, внесенные в питательную среду в дополнение к нитратам, могут оказывать стимулирующее, угнетающее и формативное действие на рост культуры тканей. Это зависит как от самой аминокислоты, так и от ее содержания в среде.

Очень часто исследователи заменяют смесь аминокислот гидрлизатом казеина. Последний способен увеличивать содержание никотина в культурах табака и подавлять биосинтез липидов во многих каллусных и суспензионных культурах.

Углеводы являются необходимым компонентом питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей растений, так как в большинстве случаев последние неспособны к автотрофному питанию.

Культуры тканей, даже зеленеющие на свету, не автотрофны в отношении углеводного питания. При изолировании и помещении на питательную среду кусочков хлорофиллоносных тканей они, как правило, теряют хлорофилл.

При выращивании на свету одни ткани остаются лишенными хлорофилла (галловая опухоль партеноциссуса, ткани сердцевинной паренхимы табака и др.). Другие ткани зеленеют на свету, но не способны обеспечивать себя полностью углеводами за счет фотосинтеза, и их необходимо выращивать на питательной средах, содержащих сахар.

При помещении кусочка ткани, изолированного из растения, на питательную среду без сахара его содержание в ткани начинает уменьшаться.

Трата сахаров зависит от сезонных изменений в самой ткани (ткани, взятые весной, теряют сахаров больше) и от содержания ауксинов в среде. При образовании каллуса старая ткань быстро теряет сахара, а в новообразующейся их количество возрастает. При помещении ткани на питательную среду, снабженную сахаром, ткани поглощают и трансформируют сахара. Количество поглощенного сахара и в особенности его превращения в другие формы зависят как от источника сахаров в среде, так и от типа ткани.

Наилучшим источником углеродного питания для большинства тканей является сахароза, обычно применяемая концентрация ее в питательной среде составляет 2-5 %. Чаще всего в качестве углеводов используют сахарозу в концентрации 3 %. Помимо сахарозы в качестве источника углеродного питания можно использовать глюкозу, фруктозу, галактозу и др. После сахарозы наиболее употребляемым источником углеродного питания для культивирования тканей растений является глюкоза. Из 33 исследованных культур (травянистых и древесных) 85 % имели отличный и хороший рост на среде с глюкозой.

На третьем месте по эффективности использования культурами тканей растений стоит фруктоза. Ее успешно используют для своего роста 2/3 культур фруктозу. Галактоза заметно отличается от глюкозы и фруктозы по действию на рост изолированных тканей растений. Более половины изученных культур почти не используют галактозу для роста. Однако есть данные, отмечающие положительную роль галактозы для культивирования тканей и органов растений.

В отличие от изолированных корней, которые могут расти только на среде с сахарозой, другие ткани, обладающие активными гидролитическими ферментами, могут использовать для питания самые разнообразные сахара и полисахариды. Способность ткани усваивать те или иные сахара зависит от ее происхождения. Перенос ткани с более бедной сахаром среды на более богатую обычно не вызывает нежелательных явлений, обратный перенос приводит к некрозам тканей.

Основное действие сахарозы состоит в увеличении уровня образования метаболитов, использование исходно повышенных концентраций сахарозы обычно приводит к росту выхода вторичных метаболитов в культурах. Влияние изначально высоких концентраций сахарозы, вероятно, состоит в увеличении осмотического потенциала среды.
Необходимо отметить влияние условий стерилизации на действие сахаров. При автоклавировании сахароза дает следы глюкозы и фруктозы, а в среде с сахарозой, которая не подверглась специальной очистке, наблюдается образование веществ, стимулирующих рост тканей.

Выращивание хлорофиллоносных и лишенных хлорофилла тканей на свету или в темноте изменяет как содержание растворимых сахаров в ткани, так и соотношение разных их групп. Различия в спектральном составе света также сказываются на углеводном метаболизме тканей.

Витамины принадлежат к активным веществам, играющим существенную роль в культуре тканей. Известно, что в процессе роста растения синтезируют необходимое им количество витаминов. Несмотря на это, исследования показывают, что при внесении витаминов в питательную среду рост ткани улучшается. Большая часть витаминов входит в состав ферментов, катализирующих многие метаболически важные реакции. Витамины делятся на водорастворимые и жирорастворимые.

В состав сред чаще всего включают водорастворимые витамины: тиамин, рибофлавин, биотин, пантотеновую кислоту, пиридоксин, аскорбиновую кислоту. При внесении полной смеси витаминов стимулирующее действие может определяться синергизмом между отдельными витаминами. По наблюдениям Хендерсона, смесь витаминов наиболее активна после слабого роста ткани в предыдущем пассаже.

Действие витаминов на рост культуры тканей зависит от способности ткани синтезировать их в оптимальном или субоптимальном количестве и от состава других компонентов питательной смеси, с которыми витамины могут взаимодействовать синергически или антагонистически. Интересно, что клеточная суспензия, полученная путем помещения ткани в жидкую среду, при пассировании значительно более чувствительна к недостатку витаминов, чем сама ткань. Исключение из среды холина и аскорбиновой кислоты приводит к увеличению одиночных суспендированных клеток. Следует отметить, что в каждом конкретном случае место отдельного витамина в сложной цепи метаболизма различно.

Клетки растений и животных более чувствительны, чем микроорганизмы, к присутствию посторонних ингредиентов, поэтому требуют химически чистых компонентов среды.

Вместе с тем некоторые питательные среды содержат натуральные биологические добавки: жидкий эндосперм кокосового ореха (кокосовое молоко), каштана, картофельный отвар и др. Они являются поставщиками более сбалансированных питательных компонентов по сравнению с искусственными средами.

В целях предотвращения возможного бактериального и грибного загрязнения в среды добавляют иногда такие антибиотики, как полиены (амфотерицин В, нистатин), карбенициллин, цефалоспорин и его производные, левомицитин, аминогликозиды (гентамицин сульфат, канамицин моносульфат), рифамгащин и др. Большинство антибиотиков неустойчиво при нагревании, поэтому их растворы стерилизуют фильтрацией через мембраны.

Наличие макро- и микроэлементов в составе культуральных сред определяется потребностями объектов культивирования. Широко применяемые в настоящее время среды Гамборга В5 и Мурасиге и Скуга (МС) (табл. 4.1, табл. 4.2) содержат по сравнению со средами Уайта значительно большие количества калия, фосфора и микроэлементов.

В настоящее время существует большое количество различных прописей питательных сред для культивирования изолированных тканей и клеток. Их состав зависит от задач культивирования, видов растений и типов эксплантов. Наиболее часто используемая среда Мурасиге и Скуга, впервые была составлена и предложена в 1962 г. Кроме того, в настоящее время широко известны среды Уайта, Нича, В5, N6 и др. (табл. 4.1), отличающиеся набором отдельных составляющих компонентов и их соотношением. Существуют и коммерческие препараты питательных сред, выпускаемые иностранными и российскими фирмами.

МС – самая универсальная среда, пригодная для образования и роста каллуса, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений. Среда Гамборга и Эвелега применима для бобовых растений и злаков. Среда Уайта обеспечивает укоренение побегов и нормальный рост стебля после регенерации. Среда Нича рекомендуется для индукции андрогенеза в культуре пыльников.

Индукция сомаклонов вишни in vitro

Цель исследований – создать полиплоидные клоновые линии гибридных триплоидов вишни степной и отборньк форм микровишни песчаной, оптимизируя условия культивирования in vitro. Объектами послужили оригинальные триплоидные генотипы из Центрального сибирского ботанического сада от скрещивания вишни степной (Prunus fruticosa Pall.) с редкими восточноазиатскими видами (P. œnescens Bois, P. serrulata Lindl., P. incisa Thunb.). Для культуры микровишни песчаной (P. pumila L.) использовали одну триплоидную и две диплоидные отборные формы селекции НИИ садоводства Сибири имени М.А. Лисавенко. Исходные экспланты стерилизовали хлорсодержащим средством «Доме-стос». Вишню культивировали на модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга с поливитаминным комплексом «Ундевит», 2 мкМ 6-бензиламинопурина (6-БАП) и 0,2 мкМ нафтилуксусной кислоты (НУК); микровишню песчаную – на среде Кворина-Лепуавра с 2 мкМ 6-БАП и 0,2 мкМ ß-индолилмасляной кислоты (ИМК). Для укоренения микропобегов обеих культур в среду добавляли 2 мкМ ИМК.

Цель исследований – создать полиплоидные клоновые линии гибридных триплоидов вишни степной и отборньк форм микровишни песчаной, оптимизируя условия культивирования in vitro. Объектами послужили оригинальные триплоидные генотипы из Центрального сибирского ботанического сада от скрещивания вишни степной (Prunus fruticosa Pall.) с редкими восточноазиатскими видами (P. œnescens Bois, P. serrulata Lindl., P. incisa Thunb.). Для культуры микровишни песчаной (P. pumila L.) использовали одну триплоидную и две диплоидные отборные формы селекции НИИ садоводства Сибири имени М.А. Лисавенко. Исходные экспланты стерилизовали хлорсодержащим средством «Доме-стос». Вишню культивировали на модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга с поливитаминным комплексом «Ундевит», 2 мкМ 6-бензиламинопурина (6-БАП) и 0,2 мкМ нафтилуксусной кислоты (НУК); микровишню песчаную – на среде Кворина-Лепуавра с 2 мкМ 6-БАП и 0,2 мкМ ß-индолилмасляной кислоты (ИМК). Для укоренения микропобегов обеих культур в среду добавляли 2 мкМ ИМК. В качестве амитотических агентов использовали трифлуралин и колхицин в концентрациях от0,005до 0,02%. Использование 0,005% трифлуралина и 0,01% колхицина при экспозиции 14 дней позволяет получать до 65,0% жизнеспособных эксплантов вишни и до 98,2% микровишни при обработке колхицином, и до 17,5% вишни идо 70,0% микровишни – в варианте с трифлуралином. Для получения полиплоидов оптимальная концентрация трифлуралина составляет 0,01%, колхицина – 0,02%. Созданы адаптированные ex vitro тетраплоидные (для микровишни) и гексаплоидные (для вишни и микровишни) клоновые линии. Плоидность оценивали по морфологическим признакам или прямым подсчётом числа хромосом в клетках меристем. Полиплоиды характеризовались замедленным развитием, извитым краем, более плотными и тёмными тканями листа, толстыми стеблями и корнями, плохим укоренением. В полевые условия высажены 17 гексаплоидных клоновых линий гибридов вишни степной и107предположительно тетраплоидных клоновых линий микровишни песчаной.

‘> Входит в РИНЦ ® : да

‘> Цитирований в РИНЦ ® : 5

‘> Входит в ядро РИНЦ ® : да

‘> Цитирований из ядра РИНЦ ® : 1

‘> Норм. цитируемость по журналу: 0,841

‘> Импакт-фактор журнала в РИНЦ: 0,59

‘> Норм. цитируемость по направлению: 0,753

‘> Дециль в рейтинге по направлению: 4

‘> Тематическое направление: Biological sciences

Источники:

http://patentdb.ru/patent/1639534
http://medbe.ru/materials/problemy-i-metody-biotekhnologii/usloviya-i-metody-kultivirovaniya-tkaney-in-vitro/
http://elibrary.ru/item.asp?id=27174698