Биохимия виноделия – виноград

Микробиология и биохимия вина

Навигация по сайту

Введение

Микробиология (от греческих слов mikros – маленький, bios – жизнь, logos – учение) изучает жизнь мельчайших, не видимых невооруженным глазом организмов, относящихся в основном к растительному миру (дрожжи, плесени, бактерии). Вследствие малых размеров (1-10 микрометров) отдельные микроорганизмы видны только в микроскоп с увеличением в 600-800 раз. Однако при определенных условиях присутствие больших скоплений микроорганизмов (микробов) становится видимым и невооруженным глазом. Так, при большой концентрации микробов в жидкости, например в бродящем виноградном соке, где концентрация дрожжей достигает 150 млн. клеток на 1 мл, жидкость становится мутной. Поэтому помутнение вина может служить признаком развития в нем микробов. Многие микробы образуют на поверхности жидкости (сусла, вина) плотную пленку.

Начало микробиологии как науки было положено А. Левенгуком, который в 1673 г. сконструировал первый примитивный микроскоп и с его помощью обнаружил целый мир неведомых до этого существ. За годы своего существования микробиология получила широкое развитие. В настоящее время выделились медицинская, ветеринарная, сельскохозяйственная и техническая микробиология, вирусология.

Способность микроорганизмов изменять химический состав окружающей их среды имеет огромное практическое значение и определяет направление технологических процессов виноделия. Винодел должен хорошо знать свойства и способности всех микроорганизмов, которые встречаются в вине и развиваются в нем, чтобы с помощью ряда технологических приемов (нагревания, охлаждения, фильтрации, облучения, введения консервантов и т. д.) воздействовать на эти микробы, стимулируя или ингибируя их жизнедеятельность, получать вина кондиционные, высокого качества.

Предметом настоящего учебного пособия является техническая микробиология, в частности микробиология виноделия, которая изучает вопросы промышленного использования микроорганизмов, условия стимулирования или ингибирования их жизнедеятельности в зависимости от требований производства.

Спиртовое брожение, как впервые было доказано работами Л. Пастера в 1857-1860 гг., вызывается дрожжами в процессе их жизнедеятельности. Позже было установлено, что основная роль при этом принадлежит комплексу ферментов, вырабатываемых дрожжами.

Луи Пастер

Проблемам микробиологии виноделия посвящены труды М. А. Ховренко, А. М. Фролова-Багреева, М. А. Герасимова, Н. Ф. Саенко, Е. И. Квасникова, Г. Ф. Кондо и др.

Биохимия (биологическая химия, физиологическая химия) изучает химический состав и химические превращения, происходящие в живых организмах и вырабатываемых ими физиологических жидкостях (молоко, плодовые и ягодные соки и т. д.). Особую роль техническая биохимия играет в таких производствах, как виноделие, хлебопечение, производство сыра, чая и пр. В СССР центром биохимических исследований стал основанный в 1935 г. А. Н. Бахом и А. И. Опариным Институт биохимии АН СССР. Ряд работ этого института посвящен биохимии винограда и вина.

Биохимия вина как главная составная часть химии вина получила широкое развитие. Благодаря применению таких специальных методов анализа, как хроматография и фотометрия, весьма расширились наши знания о веществах, входящих в состав винограда, его сока и вина, и об изменениях этих веществ – их возникновении, накоплении, распаде и т. д.

Биохимия и микробиология, в частности в применении к вину, теснейшим образом взаимосвязаны. Биохимические процессы, проходящие при сбраживании виноградного сока для получения из него вина, обусловлены действием ферментов, вырабатываемых микроорганизмами, причем их жизнедеятельность зависит от окружающей среды: ее состава, температуры и т. д. Способность микроорганизмов изменять химический состав окружающей их среды имеет огромное практическое значение и определяет направление технологических процессов виноделия.

Микробиология и биохимия вина

Биохимические превращения при созревании винограда

Навигация по сайту

Азотистые вещества винограда

Азотистые вещества винограда и его сока представлены органической и неорганической формами.

Органические азотистые вещества – белки, полипептиды, амины, амиды и др. – входят в состав каждой живой клетки. Они содержатся во всех частях виноградной грозди (табл.1).

100-600
10-40
100-400
7-100

Белки . Делятся на две основные группы: протеины (простые белки, составленные только из аминокислот) и протеиды (сложные белки, в состав которых кроме аминокислот входят еще вещества небелковой природы). В зависимости от химической природы небелковой (простетической) группы протеиды делятся на липопротеиды, гликопротеиды, хромопротеиды и нуклеопротеиды.

В состав протеинов входят альбумины, глобулины, проламины, глютеины (различие по растворимости). Белковые вещества винограда и вина представлены в основном протеидами. В состав их белковой фракции входит 17 аминокислот, среди которых преобладают лизин (6-14%) и аспарагиновая кислота (12- 20%) . Белки винограда обладают относительно невысокой молекулярной массой. Основное их содержание (60-90%) – это низкомолекулярная фракция с молекулярной массой около 10 000 и меньшее количество с молекулярной массой 24-47 тыс. Изоэлектрическая точка белков винограда лежит в пределах рН 2,8-4,2 и зависит от сорта винограда.

Белки накапливаются к стадии полной зрелости винограда. Содержание их в ягоде зависит от сорта винограда и почвы.

Белки относятся к числу самых лабильных веществ винограда, поэтому в процессе его переработки они могут подвергаться значительным изменениям, в частности, свертываясь при повышении температуры, они могут быть причиной помутнений соков и вин.

Сравнение количества белковых веществ в 11 сортах винограда из двух районов Крыма (Южный берег и Предгорье) показывает, что в зависимости от сорта иногда белков больше в одном районе, иногда в другом, однако в среднем виноград с Предгорья имеет больше белков (в мг/л):

Белки винограда значительно адсорбируются бентонитом – на этом основано применение бентонита для стабилизации вин против белковых помутнений.

Механизм биосинтеза белка был раскрыт только во второй половине ХХ в. в связи с успехами молекулярной биологии. Синтез белка осуществляется при участии нуклеиновых кислот.

Нуклеиновые кислоты подразделяются на рибонуклеиновые и дезоксирибонуклеиновые. Они были так названы по содержанию углеводов – рибозы в РНК и дезоксирибозы в составе ДНК. Нуклеиновые кислоты являются высокомолекулярными соединениями. Молекулярная масса РНК колеблется от 30-50 тыс. до 2 млн., а ДНК достигает 5-8 млн.

Синтез белков происходит в рибосомах с информационной рибонуклеиновой кислотой (иРНК), которая синтезируется на матрице ДНК (носитель наследственности). Перенос активированных аминокислот осуществляется при помощи транспортной РНК (тРНК).

Изучение нуклеиновых кислот винограда показало, что в листьях и виноградной лозе они представлены только РНК, тогда как в семенах винограда удалось обнаружить и ДНК.

Полипептиды . Представляют собой полимеры аминокислот; твердые вещества с молекулярной массой менее 10 000. Составляют около 30% азотистых веществ винограда и вина. Гидролизуясь, дают аминокислоты.

Амиды . Составляют 1-5% азотистых веществ винограда. В вине найдено до 25 видов амидов – первичных, вторичных и третичных. Из других видов органического азота в винограде и винах обнаружены нуклеиновые кислоты, нуклеозиды и нуклеотиды.

Аминокислоты . Это наиболее важная по величине и значению группа органических азотистых веществ винограда. Они служат основой питания дрожжей и других микроорганизмов, в результате чего в конце спиртового брожения около половины аминокислот переходит в дрожжевую массу и отделяется затем при первой переливке.

В процессе дезаминирования (в ходе спиртового брожения и при других биохимических процессах) от них отщепляется остаток, не содержащий уже азота, в частности различные спирты, оказывающие заметное влияние на состав и качество вина

Аминокислоты образуются в растениях за счет аминирования кетокислот аммиаком, который получается путем ферментативного восстановления нитратов:

НNО₃ → HNО₂ → (HNO)₂ → NH2ОH → NН₃.
Нитрат Нитрит Гипонитрит Гидроксиламин Аммиак

Взаимодействие аммиака с кетокислотами идет в две стадии:

Образование аминокислот возможно также путем реакции переаминирования. Так, глютаминовая кислота, передавая свою аминную группу пировиноградной кислоте, образует аланин.

Аминокислоты в растениях образуются также путем ферментативного превращения одной аминокислоты в другую. Так, глютаминовая кислота, декарбоксилируясь, образует γ-аминомасляную кислоту, а аспарагиновая – аланин. Пролин, окисляясь кислородом воздуха, образует оксипролин.

Биосинтез аминокислот в виноградном растении, по мнению С. В. Дурмишидзе и О. Т. Хачидзе, осуществляется в корнях, что подтверждается одинаковым аминокислотным составом корней винограда.

На протяжении всего вегетационного периода происходит увеличение содержания метионина и аспарагиновой кислоты, что связано с накоплением в винограде метилированных веществ. В период цветения винограда главным переносчиком органического азота является аспарагиновая кислота.

В начальный период созревания винограда в ягоде мало аминокислот. В процессе созревания их качественный и количественный состав заметно меняется (табл.2).

Таблица 2
(для увеличения изображения – кликните по таблице)

В начале созревания винограда аминокислоты расходуются на образование белков, вот почему в период с 5/IX по 12/IX наблюдается уменьшение общего содержания аминокислот.

На образование отдельных аминокислот при созревании винограда оказывают влияние микроэлементы почвы: бор, цинк, марганец и др. В частности, недостаток цинка вызывает уменьшение содержания глютаминовой кислоты, тирозина и особенно фенилаланина. В виноградном соке найдены следующие аминокислоты в L-форме (табл.3).

Таблица 3
(для увеличения изображения – кликните по таблице)

Из минеральных форм азота в виноградном сусле (и вине) встречаются аммиак и нитраты. Содержание аммиака (аммонийных солей) в винограде 25-150 мг/л, или в пересчете на азот 20-120 мг/л, что составляет 3-15% общего азота. В начале созревания винограда количество аммонийных солей доходит до 50% от количества общего азота. При созревании винограда они расходуются на синтез аминокислот.

Проблемы и перспективы химии и биохимии вина в направлении энзимологии

Проблемы и перспективы химии и биохимии вина в направлении энзимологии.

С целью снижения себестоимости вина и улучшения его качественных показателей необходимо знать роль ферментных препаратов в биохимических процессах виноделия.

Проблемы построения ферментов тесно переплетаются с физико-химическими проблемами – химической кинетикой и катализом в виноделии. Сегодня внесено много нового и интересного в представление о структуре ферментов, о их присутствии в нативном состоянии в виде сложных комплексов. Анализ строения ферментов в сопоставлении с активностью, которую они проявляют при разных условиях, позволил выявить значение отдельных аминокислот в формировании активного центра ферментов. Выяснена структура многих коферментов, их значение для ферментативной активности, а также связь между коферментами и такими биологически активными веществами как витамины.

На первой стадии переработки винограда происходит разрушение ягоды посредством механического, термического и ферментативного действия на виноград.

Химический состав сока в виноградной ягоде отличается от химического состава сусла после переработки винограда, так как в сусло переходят вещества из мякоти, кожицы, косточек и из гребней. При этом сусло контактирует с кислородом воздуха и проходят биохимические (ферментативные) изменения веществ сусла до начала процесса брожения.

Биохимические реакции в сусле разделяются на гидролитические и окислительно-восстановительные, которые проходят под действием полифенолоксидазы, пероксидазы, аскорбиноксидазы, оксидазы диоксималеиновой кислоты, флавопротеиновых оксидаз, дегидрогеназ органических кислот и др. Первостепенную роль при окислении сусла играет полифенолоксидаза, которая адсорбирована на твердых частях ягоды. Фенольные и красящие вещества окисляются свободным кислородом в основном при контакте сусла с мезгой. Чтобы замедлить процессы окисления сусла необходимо уменьшить аэрацию, быстро отделить его от мезги, осветлить сусло, внести в него антиоксидант (диоксид серы) и инактивировать полифенолоксидазу, например, адсорбцией бентонитом.

Под действием полифенолоксидази фенольные вещества окисляются до хинонов. Аскорбиновая кислота, которая находится в сусле, восстанавливает хиноны снова к полифенолам. Когда аскорбиновая кислота полностью окислится, в сусле накопится соответствующее количество хинонов, которые могут окисляться далее и давать продукты конденсации буро-коричневого цвета. В результате таких биохимических процессов сусло буреет и при следующем сбраживании можно получить вино пониженного качества. Этот процесс можно предотвратить, если добавить в сусло диоксид серы. Оптимальный вариант введения диоксида серы – в мезгу сразу после ее получения.

В первую очередь подвергаются окислению фенольные и красящие вещества, в результате этого окислительно-восстановительный потенциал среды повышается с 280 до 388 мВ уже через несколько часов контакта мезги с воздухом.

В процессе настаивания на мезге фенольные вещества переходят в сусло. После 20 ч. настаивания количество фенольных веществ уменьшается вследствие их окисления, конденсации и выпадения в осадок, а также вследствии обратной адсорбции на мезге. Доказано, что в свежевыдавленном сусле через 70 часов после отделения его от мезги количество фенольных веществ снижается на 40 %.

При измельчении виноградной ягоды изменяется направленность ферментативных процессов, особенно после разрушения клеток кожицы. Если в целой ягоде процессы синтеза преобладают над процессами распада. С разрушением ягоды начинается усиление гидролизирующего действия ферментов. Максимума этот процесс достигает через определенное время, при этом синтезирующая способность падает.

В связи с такой декомпенсацией ферментного аппарата ягоды, происходят значительные изменения в количестве и составе полифенолов, частичное расщепление фенольных веществ. Разрушение запасных и сложных плазмовых белков с образованием водорастворимых протеинов, полипептидов и аминокислот значительно усиливается. Изменяется количество пектиновых и других веществ. Таким образом, чем сильнее будет степень измельчения ягод винограда, тем более полно будет проходит ферментация мезги.

При переработке винограда необходимо эффективно проводить процесс отделения сусла от мезги. Для получения неферментированного сусла, необходимо ограничивать степень измельчения и время переработки винограда на сусло. Идеальным в этом случае будет прессование винограда целыми гроздями. Под действием ферментов пектинэстеразы и полигалактуроназы пектин виноградной ягоды расщепляется на легкорастворимую моногалактуроновую кислоту, метиловый спирт и другие продукты.

Известно, что большое количество пектиновых веществ локализовано в кожице виноградной ягоды. При измельчении под действием пектолитических ферментов эти вещества переходят в сусло, и происходит их разрушение. В результате этого облегчается процесс прессования, ускоряется и увеличивается сокоотдача.

Для прохождения биохимических процессов ферментации нужно время, которое определено технологическим регламентом. Доказано, что настаивание на мезге ускоряет прохождение ферментации. С целью ускорения процессов ферментации можно в измельченную мезгу добавлять предварительно ферментированную массу, или вносить пектолитические ферментные препараты, которые получены из разных продуцентов.

Пектолитические ферментные препараты в числе других ферментов содержат пектинэстеразу и полигалактуроназу, которые активно расщепляют пектин виноградного сусла на легкорастворимую моногалактуронову кислоту и на другие соединения. Вследствии расщепления пектина вязкость сока уменьшается и улучшается его фильтрационная способность.

Общий выход сусла в результате действия пектолитических ферментных препаратов увеличивается на 2. 3 %, а количество сусла-самотека – на 10. 15 % вследствие уменьшения прессовых фракций. При действии этих препаратов на мезгу на протяжении 16. 18 ч. скорость фильтрования сусла возрастает в 6. 8 раз. Ферментация мезги позволяет увеличить содержание в сусле эфирных масел, а также екстрактивных, фенольных и красящих веществ. Молодое вино, которое получено из мезги, обработанной пектолитическими ферментными препаратами, как правило, имеет высшие качественные показатели, чем вино контрольное. При выдержке такие вина созревают значительно быстрее, приобретая в окраске буро-коричневые тона.

Таким образом, обработка мезги пектолитическими ферментными препаратами улучшает процесс отделения и осветления сусла, но в дальнейшем может приводить к усилению процессов окисления в молодом вине. А потому молодые виноматериалы должны проходить технологические обработки для инактивирования ферментных препаратов после их основного использования.

На энергию биохимических процессов при брожении влияет степень осветления сусла. В результате обработки ферментными препаратами сусло интенсивно осветляется и брожение протекает плавно, без сильного вспенивания, температура бродящего сусла поднимается не очень высоко, что особенно важно при сбраживании в больших аппаратах.

Сегодня наука и производство работают над тем, чтобы дать специалистам-виноделам принципиально новые решения по применению ферментных препаратов для ускорения процесса осветления, биохимического процесса брожения и созревания виноматериалов, стабилизации и гармонизации вин. Для усиления выражения аромата, который отвечал бы данному сорту винограда, а также для улучшения осветления сусла и разрушение пектина в виноградной мезге, освобождение связанных ароматических соединений, чтобы типичный для винограда букет стал более выразительным и интенсивным, для увеличения сокоотделения и надежной стабилизации вин, нужны экологически чистые высокоэффективные ферментные препараты отечественного и заграничного производства.

При обработке виноматериалов ферментными препаратами необходимо переходить на непрерывные биохимические процессы с использованием иммобилизованных экологически чистых растительных биополимерных комплексов (пищевых волокон).

В Одесской национальной академии пищевых технологий под руководством проф. Капрельянца Л. В. разработана технология концентрированных препаратов пищевых волокон на основе побочных продуктов и отходов пищевой промышленности. От других пищевых волокон они отличаются большим содержанием биополимерных компонентов, активированными свойствами, которые обуславливают их специфическую физиологическую эффективность, отсутствием антипотребительских веществ, экологической безопасностью и гарантированной возможностью иммобилизации на них ферментных препаратов при обработке виноматериалов.

Разработка новых биотехнологий ферментных препаратов должна основываться на генной инженерии в условиях винодельческих предприятий. Генная инженерия разрешит производителям ферментных препаратов разрабатывать и выпускать большое количество дорогих ферментов независимо от их происхождения для интенсификации биохимических и других технологических процессов в виноделии.

Доказано, что генетическая информация сохраняется в хромосомах в виде диоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), которая имеет двоспиральную структуру. В этой молекуле генетическая информация сохраняется в виде линейной последовательности. Так, например, линейная запись из 1200 букв, которые содержатся в индивидуальном гене, может быть переведены в цепь из 400 аминокислот, которые представляют соответствующий фермент – генетический код расшифровки. Остается только исследовать, как аминокислотная цепь непроизвольно входит в чрезвычайно сложную структуру активного фермента.

Сегодня уже открыты рестракционные (ограниченные) ферменты (рестриктазы), на которых базируется генная биотехнология. Рестриктазы разрезают ДНК в нескольких специфических участках, что дает возможность выделить отдельные гены, которые в сумме составляют не больше 0,1 % ДНК, содержащиеся в хромосоме.

Используя ферменты-лигазы (соединяют ферменты), с помощью рестриктаз, один соответствующий ген можно встроить в хромосомы (плазмиди), а потом перенести в новую клетку, где новая комбинация ген-плазмиду может прижиться как новая полученная единица. Так и происходит клонирование (образование идентичных потомков-клонов неполовым размножением). В результате проведенного клонирования появляется популяции клеток, или организмов с одинаковым набором генов (генотипов).

Таким образом, в производстве ферментных препаратов для ускорения биохимических и других технологических процессов в виноделии необходимо решить такие проблемы:

1. предусмотреть изменения в генетическом коде фермента для улучшения его каталитической способности. Для этого необходимо установить необходимые свойства фермента – его специфичность и стабильность зависит от рН среды, температуры и других факторов;

2. найти соответствующий фермент с необходимыми свойствами, потом микроорганизм, который его продуцирует, ввести в культуру и идентифицировать, в дальнейшем у него вызывают мутации (изменения) с помощью химических или радиологических средств. Все это делается для увеличения выхода основного продукта и достижения быстрого роста культуры, а также для исключения образования нежелательных побочных продуктов. В конце определяются оптимальные условия для ферментации биохимических процессов и проверяются экологические стороны биотехнологии. Готовый новый продукт проходит инспекцию для получения разрешения на использование в винодельческой промышленности.

Рациональное и эффективное использование новых высокоактивных ферментных препаратов можно реализовать лишь при их закреплении на водонерастворимой основе или при включении в полупроницаемую мембрану за счет химических связей. Все это разрешит многократно использовать высокую активность ферментных препаратов и перевести виноделие на непрерывные режимы.

Источники:

http://vinobio.narod.ru/
http://vinobio.narod.ru/7-7.html
http://vinograd-vino.ru/stati-i-issledovaniya/572-problemy-i-perspektivy-khimii-i-biokhimii-vina-v-napravlenii-enzimologii.html